含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

 【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。     

掌叶半夏凝集素基因表达载体的构建与鉴定

从掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)块茎中提取总RNA,反转录合成cDNA.根据GenBank中已报道的天南星科凝集素基因序列,设计带有酶切位点的表达引物,用RT-PCR方法扩增出掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)基因.PPA经双酶切后与表达载体pGEX-6P-3连接,构建pGEX-PPA重组表达载体.通过PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明,重组载体pGEX-PPA构建成功,为进一步进行PPA的原核表达及其功能研究奠定了基础.     

基于可见/近红外光谱的黄河口区土壤盐分及其主要离子的定量分析

【目的】定量、准确地监测盐渍土,对其防治和农业可持续发展至关重要,论文旨在明确黄河口区土壤盐分及其主要离子的特征光谱,建立适用于该区域的土壤盐渍化定量分析模型,提高其定量分析的精度和稳定性。【方法】首先以山东省垦利县为研究区,于2014年10月5—9日野外采集代表性土样96个,对土样风干后,采用土壤化学分析方法室内分析盐分及其主要离子(Cl~-、Na~+、Ca~(2+))含量,并采用美国ASD Fieldspec 3光谱仪测定土样可见/近红外高光谱数据,对光谱反射率进行去噪、一阶导数变换等预处理;然后基于盐分及其主要离子不同含量的样本光谱分析盐分及其主要离子的光谱响应,在此基础上,对样本的土壤盐分及其主要离子含量与反射率的一阶导数光谱进行逐波段的相关分析,按照相关系数高且显著的原则,选取各自的敏感波段,再根据敏感波段的交叉情况选取集中波段为特征波段,进而选取特征波段中具有极值相关系数的波段作为显著特征波段,综合确定表征土壤盐分及其主要离子(Cl~-、Na~+、Ca~(2+))的特征光谱;最后分别采用多元线性回归(multiple linear regression,MLR)、支持向量机(support vector machine,SVM)和随机森林(random forest,RF)方法构建土壤盐分及其主要离子的定量高光谱分析模型。【结果】研究区土壤盐分及其主要离子(Cl~-、Na~+、Ca~(2+))含量的光谱曲线形状和走势整体一致;土壤盐分及其主要离子(Cl~-、Na~+、Ca~(2+))的光谱响应谱区为1 320—1 495、1 790—1 920、2 120—2 290 nm;基于相关分析的土壤盐分及其主要离子的敏感谱区为1 490—1 520、1 890—1 930nm;最后综合光谱响应及相关分析确定土壤盐分及其主要离子的特征波段为1 493、1 801、1 911和2 289 nm,显著特征波段为1 493和1 911 nm。模型结果显示基于2个显著特征波段反射率一阶导数的模型精度均与4个特征波段的模型精度相当,表明显著特征光谱作为盐分及其主要离子的特征光谱进行其定量分析的有效性。比较3种建模方法,RF模型的预测效果最好,SVM模型次之,而MLR模型精度最低;对于盐分、Cl~-和Na~+,3种方法构建的模型均可有效地用于其定量分析,精度较高且稳定,然而Ca~(2+)预测精度还有待提高。通过综合比较分析,基于显著特征波段(1 493和1 911 nm)反射率一阶导数构建的随机森林(RF)模型对盐分、Cl~-和Na~+均具有较好的估测精度和稳定性,也可用于Ca~(2+)的定量估测。【结论】基于光谱响应及相关分析综合确定盐分及其主要离子的显著特征光谱(1 493和1 911 nm反射率一阶导数),进而采用随机森林方法构建盐分及其主要离子的定量估测模型,适用于黄河口区土壤盐渍化信息的有效提取。     

菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

[目的]克隆菊花CmAPETALA1基因(CmAP1)并构建植物表达载体,为该基因功能的遗传改良打下研究基础.[方法]采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因,运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析,利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析,并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接,构建植物表达载体.[结果]克隆获得的CmAP1基因(GenBank登录号KU872999)编码区开放阅读框(ORF)长741 bp,编码246个氨基酸;CmAP1蛋白属亲水性蛋白,分子质量约28.3 kD、理论等电点(pI)为8.76,预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明,CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%,属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支;实时荧光定量PCR分析结果表明,CmAP1基因在花蕾中表达量极高,在舌状花和筒状花中表达量较低,而在营养器官中仅痕量表达.将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上,可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1.[结论]CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用,成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改变菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础.     

基于音频技术的肉鸡采食量检测方法研究

【目的】通过研究肉鸡采食音频提出一种基于音频技术的肉鸡采食量检测方法,以摆脱目前我国肉鸡采食量数据主要是人工测量群体采食量的现状,为准确获取肉鸡采食量信息提供技术支持。【方法】录音笔采集到的采食音频经分帧加窗、端点检测等预处理后,将有效声音片段提取出来,依托不同声音的功率谱密度曲线差异,使用单分类支持向量机(OC-SVM)对提取出的有效声音片段进行分类识别。利用音频技术检测肉鸡进食时的啄食次数,分析确定啄食次数与采食量的关系,利用啄食次数与采食量的高相关性计算肉鸡采食量。【结果】利用音频技术检测的肉鸡啄食次数与采食量高度相关,决定系数(R~2)=0.982 5。啄食次数计算正确率为94.58%,采食量计算正确率为91.37%。【结论】该方法可用于肉鸡采食量测定。     

基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建

[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用Xcm I内切酶制备的T栽体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUCl9质粒的HindIII和BamHI位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3’末端突出一个T碱基的T栽体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95％以上。[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。     

猪IL-18成熟蛋白基因重组真核表达载体的构建及其抗病毒作用研究

应用RT-PCR方法从三元猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18成熟蛋白(pmIL-18)基因,经克隆测序表明,pmIL-18基因长474bp,编码157个氨基酸。序列分析发现,与已发表的pmIL-18基因序列同源性很高,均为99%以上。将pmIL-18基因插入表达载体pcDNA3.1,成功构建了pmIL-18基因的重组真核表达载体pcD-NA3/pmIL-18。将重组质粒转染COS7细胞,经SDS-PAGE及Western-blotting分析表明,pmIL-18基因在COS7细胞中获得了瞬时表达。收集转染细胞培养上清,检测pmIL-18抗病毒活性,结果表明,转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒没有明显的抑制作用。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

对一种多基因组装方法的改进

改建了基于Cre/LoxP重组的2个供体载体和1个兼容Gateway系统的供体载体:pYLd1GW/pYLd2GW、pYLd1GW35s/pYLd2GW35s和pYLd1GWMPK/pYLd2GWMPK。在改建载体的基础上构建了2个供体载体pYLd1GWMdSPDS1和pYLd2GWCBF1,并将2个基因构建于受体载体pYL1305,得到双价表达载体pYL1305MC。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR检测和GUS组织化学染色检测发现,双价基因已成功转入烟草。对6株转基因烟草进行荧光定量PCR检测,发现在不同植株中同一基因表达量差异很大,但2个基因表达量差异趋势一致。     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。