猪传染性胃肠炎病毒S与M基因融合表达载体及IRES连接双基因共表达载体的构建

目的:研究如何提高猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)中主要抗原基因S与M基因对猪传染性胃肠炎的免疫调节作用,进一步探究基因疫苗的有效开发途径。方法:通过两种方法应用牛β酪蛋白启动子构建S和M融合基因表达载体以及构建IRES连接M和S双基因共表达核酸疫苗载体。结论:成功构建好M和S融合基因表达载体及IRES连接的M和S双基因真核共表达载体,并为利用乳腺生物反应器生产可食性疫苗提供有效措施。     

细菌耐药颉颃剂的研究现状及应用

作者介绍了具有颉颃细菌耐药性作用的物质的研究应用进展情况，包括灭活酶抑制剂、药物渗透促进剂、外输泵抑制剂、细菌生物被膜抑制剂、抗菌药物增强剂、耐药质粒消除剂等。     

瘤胃脂肪分解菌实时荧光定量PCR方法的构建

为定量测定瘤胃脂肪分解菌,试验构建了脂肪分解菌实时荧光定量PCR的标准品及标准曲线。提取瘤胃微生物总DNA,以脂肪分解菌16S r DNA特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物,与PMD19-T Vector连接并转化大肠杆菌。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定后,将提取的质粒DNA进行梯度稀释并作为模板,利用荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果显示:PCR产物与目的基因的相似性大于99%,以不同稀释度的重组质粒为模板获得的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,构建了相关系数接近1的标准曲线,且熔解曲线峰值单一。试验建立的实时荧光定量PCR方法可用于瘤胃脂肪分解菌的定量检测,为进一步研究该菌在反刍动物瘤胃发酵中的分子机理奠定了基础。     

连续热裂解法大规模提取质粒DNA

选择质粒保有率高及最适合发酵的TOP10菌株,在传统的煮沸裂解法提取质粒的基础上进行了提取方法的改进,使用恒流泵和热交换螺旋管,使菌体在流动过程中完成热裂解,释放质粒DNA。改进后的方法裂解温度可降到70",提取工艺流程简单,缩短了提取时间,提高了质粒DNA的提取效率。利用本方法提取的质粒大小正确、纯度合格,每升发酵液得率平均为100mg质粒DNA。     

一种适合转基因棉CpTI和cry1A基因剂量测定的标准质粒的构建和应用

在转基因检测领域,标准质粒以容易获得、纯度高、成本低和稳定性好的优点逐渐被广泛应用,适合同时检测多个靶标基因的需求。本研究针对我国抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)的主要外源基因类型,构建含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)、苏云金杆菌晶体杀虫蛋白基因(cry1A)和棉花内标准基因硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因(Sad1)的多靶标质粒pMD-CCS作为标准质粒,建立了CpTI和cry1A基因的实时荧光定量PCR方法。测定了我国9个抗虫棉品种中的CpTI和cry1A基因剂量,显示科棉3号等3个抗虫棉品种中CpTI基因的平均剂量为0.020~0.018拷贝/基因组,cry1A基因的平均剂量为1.377~2.136拷贝/基因组;鄂杂棉1号F₁等6个抗虫棉品种中cry1A基因的平均剂量为0.887~2.564拷贝/基因组,定量结果的标准差(SD)范围在0.001~0.149之间。结果说明,pMD-CCS适合作为标准物质用于抗虫棉中CpTI和cry1A基因的定量测定。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5''端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

发根农杆菌的研究进展及其应用

阐述了发根农杆菌的性质及Ri质粒的结构和功能,介绍了发根农杆菌的转化机制及其转化方法,分析了影响发根农杆菌成功转化的因素,综述了发根农杆菌在理论研究、植物基因工程、植物品种改良、植物次生代谢产物生产和植物栽培生根等方面的应用。     

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优选

采用酚/氯仿少量提取法、异丙醇沉淀法、简便快速的煮沸法以及微波炉法提取细菌质粒,然后分别对各种方法所提取的质粒进行琼脂凝胶电泳分析,并用紫外分光光度计测定其OD值,对各种方法的优劣性进行全面分析,结果表明异丙醇提取法所提取的质粒DNA纯度和产量高(其DNA片段荧光较强,具有清晰的亮带,OD260/OD280约为1.77,DNA样品浓度约为195μg/mL),且重复性好,具有结果稳定的特点,达到了分子生物学试验要求,适合大多数试验室使用。     

质粒转化药用植物的研究进展

本文对Ri质粒的结构、转化机制、转化方法、发根的生长与鉴定及运用这一技术获得药用植物次生代谢产物的研究进展作了简要概述。