猪血凝性脑脊髓炎病毒HE基因的克隆及真核表达

应用特异性引物,从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出HE蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHE。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHE,回收目的基因HE片段并将其定向克隆到pPiCZαA中,构建重组质粒pPiCZαA HE。用BstXⅠ酶切pPICZαA HE使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1％甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及westem blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子量为43kD的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的HE蛋白片段在Pichia Pastoris中获得成功表达。     

北方春大豆品系大豆花叶病的鉴定与抗原筛选

为了详细了解我国近几年来育成的北方春大豆品系对花叶病毒病的抗性表现,本研究通过分析2003～2007年的国家北方春大豆品种区域试验和生产试验病毒病2个流行株系(SMV1和SMV3)抗性鉴定数据,筛选兼抗SMV1号和SMV3号株系的抗原有19份,专抗SMV1号株系的抗原55份,专抗SMV3号株系的抗原20份,并发现辽宁省的新品系对2个株系的抗性表现都是最好的,尤其是表现抗病级别(R)的品系较多;而黑龙江省对2个株系的抗性表现都是最差的,尤其是对3号株系,大部分表现感病。建议黑龙江省今后要重视花叶病毒与抗性育种,可以考虑从辽宁和吉林两省引入抗原,进行品种选育和抗性改良。     

脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建

携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID₅₀)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP...     

FMDV OA/58病毒株VP3蛋白结构的模拟与分析

以口蹄疫病毒株OA／58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和BarnHⅠ、HindⅢ双酶切法鉴定。分析表明,口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的（P〉0．05）;而它们在氨基酸水平上的变异率差异显著（P〈0．05）。该毒株与20株源于GenBank中的VP3氨基酸序列比较发现其保守区主要位于第1～24、26～35、37～43、45～57、61～122、124～173、175～209、211～220位。运用同源模建,OA／58 VP3蛋白三维空间结构可分为A,B,C3个结构区域。保守区氨基酸残基在维持VP3蛋白的空间构象和功能方面具有重要作用。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coli BL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定.Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中.包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性.     

11种植物提取物抗烟草花叶病毒活性研究

为开发环境友好型的植物源抗病毒剂,以烟草花叶病毒(TMV)为供试病毒,采用半叶枯斑法,研究了11种植物不同溶剂提取物的抗TMV活性。结果表明：当浓度为1 mg/mL时,臭灵丹石油醚提取物、红花月见草乙酸乙酯提取物、臭灵丹水层提取物对TMV增殖有显著抑制(P＜0.05)活性抑制率分别为68.47%、80.19%、94.57%;臭灵丹石油醚提取物、钻叶紫菀乙酸乙酯提取物、臭灵丹水提取物对TMV有较强的钝化活性,抑制率分别为80.00%、76.38%、83.33%。TAS-ELISA检测表明,臭灵丹、风轮草、珊瑚樱、钻叶紫菀、益母草、拔毒散等植物提取物对普通烟K326内病毒增殖具有显著抑制作用(P＜0.05),并且明显好于阳性对照药剂宁南霉素。     

中国水产动物病毒学研究概述

为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法,实验以胖头鱥上皮细胞系 (FHM)为材料,构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒,利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度 (0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0 μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素对启动子活性的影响,并利用鲤春病毒血症病毒 (spring viremia of carp virus,SVCV)和蛙虹彩病毒 (rana grylio iridovirus,RGV)验证阳性药物的抗病毒效果。结果显示,Nrf2、HO-1启动子序列中存在FOX家族、IRF家族等多种转录因子的结合位点,并分别存在1个和3个与甲基化相关的CpG岛。双荧光素酶报告实验显示,水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素可激活Nrf2、HO-1启动子。药物浓度梯度实验显示,6.3 μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯可显著上调Nrf2和HO-1的启动子活性。病毒感染后的细胞病变效应、病毒的复制及病毒滴度结果均表明姜黄素和穿心莲内酯可抑制SVCV和RGV的感染。综上,本实验建立的pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1启动子报告质粒,可用于抗水生病毒药物的筛选,也为Nrf2、HO-1转录调控机制的研究提供了工具。

     

番茄抗番茄斑萎病毒病育种研究进展

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）是危害番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）最重要的病原菌之一,在中国及世界范围内已成为限制番茄生产的重要因素。利用自然番茄抗病资源及抗病基因是控制TSWV的有效方法。秘鲁番茄（Lycopersicon peruvianum Mill.）和智利番茄（Lycopersicon chilense Mill.）等野生番茄是目前发现的抗TSWV的主要自然资源。其中,秘鲁番茄中的显性抗病质量基因位点Sw-5在TSWV抗病遗传育种中发挥重要作用。后续开发和培育了多种与Sw-5连锁的分子标记及含有Sw-5的抗病品种。除此之外,病毒RNA介导基因沉默技术在番茄TSWV抗病育种中也逐渐受到重视。由于目前陆续出现了打破Sw-5基因位点的TSWV分离种,因此今后的工作亟须发掘TSWV新的抗病资源和基因。     

Detection of arboviruses in Culicoides(Diptera: Ceratopogonidae) collected from animal farms in the border areas of Yunnan Province,China

Biting midges of the genus Culicoides(order Diptera, family Ceratopogonidae) are potential biological vectors for the transmission of certain arboviruses among humans, livestock, and wild animals. This study collected a total of 405 Culicoides individuals from seven animal farms located in five counties in the border areas of Yunnan Province, China, and examined the Culicoides species composition and the major arboviruses carried by the Culicoides species. The collected Culicoides were classified into seven species with variable abundances: Culicoides arakawae(5.43%, 22/405), Culicoides homotomus(1.23%, 5/405), Culicoides obsoletus(19.75%, 80/405), Culicoides orientalis(17.28%, 70/405), Culicoides oxystoma(29.38%, 119/405), Culicoides peregrinus(5.68%, 23/405), and Culicoides nipponensis(21.23%, 86/405). Among the seven species, C. oxystoma and C. nipponensis were distributed in all the five counties with abundances of 13.33–44.87% and 10.00–46.83%, respectively, suggesting that these were the dominant species of Culicoides widespread on animal farms in the border areas. PCR was used to detect major arboviruses in the collected Culicoides specimens, including bluetongue virus(BTV), Japanese encephalitis virus, Dengue virus, Zika virus, African swine fever virus, and African horse sickness virus. Among the tested viruses, only BTV serotype 1 was tested positive in C. oxystoma specimens collected from a buffalo farm. Culicoides oxystoma was the dominant species on animal farms in the sampled areas, but it has not previously been documented as positive for BTV in China. The current results thus suggest that C. oxystoma could be an important vector for BTV transmission in these border areas, which, however, needs to be confirmed by further comprehensive experiments. Overall, the present study provides the first profile of Culicoides species on animal farms in the China, Vietnam, and Myanmar border areas, establishes the prevalence of arboviruses carried by these Culicoides species, and suggests the vector potential of C. oxystoma species for the transmission of BTV.     

猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究进展

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是猪群中的一种免疫抑制性传染病,是严重危害我国养猪业的主要疫病之一,应用各种诊断技术对该病做出准确的诊断是预防和控制该病的前提。PRRS诊断技术包括检测病毒、检测血清抗体技术及分型诊断,涉及的技术和方法包括病毒分离、免疫组化、RT-PCR、间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、酶联免疫吸附试验和基因芯片技术等。每种诊断技术都有其各自的优势和局限性,应根据研究目的及工作条件等综合情况予以选择,文章就各种诊断技术的原理、方法及特点进行了概述和比较,并对今后的应用前景和发展趋势进行了展望。