基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。     

基于线粒体及核DNA序列的河南烟草黑胫病菌群体遗传多样性分析

本研究选取2011年采自河南烟区的32个菌株,根据4个核基因(包括rDNA ITS、β-tubulin、Ras和Gpi基因)和1个线粒体基因(Cox1)的保守序列,克隆和测序分析160个相应的基因DNA片段。结果显示,这5个基因DNA序列在病菌群体内碱基序列与参照基因序列相比保守度在83%~100%不等,平均基因型多样性指数(M)为1.422 7。综合使用5个基因联合序列联合构建群体进化系统树,揭示了分布于河南省14个县区的32个分离菌系可分为2个明显的组,包括15个不同的联合基因型,基因型多样性指数为2.35,反映了病菌致病变种内存在的遗传变异多样性。其中,最优势的2个联合基因型分别涵盖8个c基因型菌系和6个e基因型菌系。然而,各基因型间遗传分化的总水平很低,组间的遗传距离仅为0.000 5,说明烟草黑胫病菌在河南生长烟草中的菌株可能属于同一有效群体。同时,不同分化菌株遗传亲缘关系与地理来源之间也没有显著的相关性,表明烟草黑胫病菌河南群体内存在密切的菌源交流,没有形成明显的地理亚群体分化。本研究结果可广泛应用于大规模黑胫病菌群体菌系的动态检测,服务于烟草抗黑胫病育种和品种合理布局。     

乌鲁木齐城市土壤磁化率特征及其环境意义

对乌鲁木齐市区及其周边地区45个地点的土壤样本进行磁化率测定。结果表明,乌鲁木齐城市土壤磁化率大都处于中低值区域,具有空间差异性的特征,进而结合采集点的土壤环境状况分析了乌鲁木齐城市土壤的环境特征,探讨乌鲁木齐城市土壤磁化率表征下土壤污染的影响机制。     

共振光散射法对蔬菜中六种拟除虫菊酯类农药残留的测定

在p H7.0的Britton-Robinson缓冲液和适量丙酮存在条件下,以吐温-80为稳定剂,高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯和氯氰菊酯可使体系共振光散射强度显著增强。在最大散射波长363 nm处有良好线性关系,其检出限为0.069~0.113μg/m L。蔬菜样品经乙腈超声提取,弗罗里硅土固相萃取柱净化后,在0.5和1.0 mg/kg添加水平下,各农药的回收率在86.7%~98.0%,相对标准偏差小于6.35%,结果令人满意,据此建立了检测拟除虫菊酯类农药残留量快速、灵敏的新方法。     

铅离子印迹磁性材料的制备及其对Pb(Ⅱ)的吸附去除研究

[目的]制备铅离子印迹和非印迹磁性材料,研究两种材料对Pb(Ⅱ)的吸附去除行为,考察两种材料对Pb(Ⅱ)的吸附选择性,探索其脱附和循环利用性.[方法]采用透射电镜、红外光谱、X射线衍射光谱和能量色散谱等方法对两种材料的形貌和结构进行表征;采用静态吸附法,以原子吸收为检测手段,探讨了pH值、反应时间及Pb(Ⅱ)初始浓度等因素对Pb(Ⅱ)吸附能力的影响;采用Langmuir等温吸附模型和Ho准二级动力学方程对其进行热力学和动力学模拟研究;以Cd(Ⅱ)为竞争离子,研究两种材料对Pb(Ⅱ)吸附选择性;以硝酸为脱附试剂,考察其脱附和循环利用性.[结果]1)与Fe3O4 10 nm的粒径相比,铅离子印迹磁性材料粒径增至80～90 nm;两种材料红外光谱图中557 cm-1处出现强吸收峰,证实Fe-O键存在,2 940 cm-1和1 084 cm-1处的吸收峰证实C-H和Si-O键存在;X射线衍射光谱图显示,它们都具有Fe3O4晶型及SiO2壳层;能量色散谱结果显示,它们主要构成元素为C、O、Si、S和Fe,说明Fe3O4磁核已被SiO2包覆,且巯基已成功键合至两种材料的表面.2)在低酸度时Pb(Ⅱ)基本不被两种材料吸附;当pH值从3增至7时,吸附率不断增大并达到最大,且非印迹材料对Pb(Ⅱ)的吸附率低于印迹材料对Pb(Ⅱ)的吸附率.3)铅印迹磁性材料对Pb(Ⅱ)的吸附量随时间的增加而升高,最后达到平衡吸附.4)随着溶液中Pb(Ⅱ)初始浓度的增加,铅印迹磁性材料对Pb(Ⅱ)的吸附量先是急剧上升,然后达到饱和吸附.5)铅印迹磁性材料对Pb(Ⅱ)的吸附动力学和热力学分别符合准二级吸附模型和Langmuir等温吸附模型.6)铅印迹磁性材料对Pb(Ⅱ)/Cd(Ⅱ)选择吸附系数K为29.75,对Pb(Ⅱ)/Cd(Ⅱ)的相对选择系数是非印迹磁性材料的5.86倍,说明该材料对Pb(Ⅱ)具有良好的吸附选择性.7)研究了HNO3对保留在铅印迹磁性材料上Pb(Ⅱ)的脱附影响,结果显示0.5 mol·L-1 HNO3可定量脱附Pb(Ⅱ),且材料可重复使用5次而脱附率无变化.[结论]在pH 7、反应时间为60 min及Pb(Ⅱ)初始质量浓度为10 mg·L-1时铅印迹磁性材料对Pb(Ⅱ)的最大吸附容量可达38 mg·g-1,可有效去除水中Pb(Ⅱ);该材料对Pb(Ⅱ)具有一定的选择性且具有很好的再生性.     

灰树花交配型鉴定分析

[目的]鉴定灰树花交配型,为灰树花杂交育种提供理论依据.[方法]灰树花孢子萌发后挑取单孢进行镜检,收集孢子单核体;采用原生质体单核化获得原生质体单核体并通过互配确定标准测交菌株T1和T2;采用标准测交菌株与孢子单核体配对及孢子单核体互配后,进行孢子单核体交配型分类,并利用核迁移试验和OWE-SOJ技术鉴定孢子单核体交配型.[结果]分离鉴定获得7 1株灰树花孢子单核体菌株,原生质体单核化获得17株原生质体单核体菌株,其中标准测交菌株Tt(A1B1)10株、T2(A2B2)7株;鉴定71株孢子单核体分别为T1、T2、T3和T4型,其中T1型28株、T2型35株、T3型4株、T4型4株;核迁移试验鉴定T1、T2、T3和T4的交配型分别为A1B1、A2B2、A2B1和A1B2,OWE-SOJ鉴定结果分别为A1B1、A2B2、A1B2和A2B1.[结论]灰树花属于四极性交配型系统,其交配型分析应以核迁移试验为准,OWE-SOJ技术不适用于灰树花的交配型分析.     

磁珠富集法开发长臀鮠微卫星分子标记

为长臀鮠遗传育种、种质鉴定和种苗流放等提供理论依据,采用磁珠富集法开发长臀鮠(Cranoglanis bouderius)微卫星分子标记,筛选获得阳性克隆进行分析,选取侧翼较长的序列,用Primer Premier 5.0设计合成引物。结果表明:从596个白斑中筛选获得80个阳性克隆,测序获得微卫星序列47个,其中完美型31个(66%),非完美型14个(30%),复合型2个(4%)。设计合成32对引物,通过优化反应条件,得到27对引物能扩增特异条带,其中多态性引物24对。     

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断.     

核磁共振技术在枯草芽孢杆菌的抗菌物质结构鉴定中的应用

核磁共振(NMR)技术是化合物结构鉴定的一种重要的方法。该文简单介绍了NMR技术的基本原理,及NMR技术在枯草芽孢杆菌所产的多肽、脂肽类抗菌物质结构鉴定中的运用概况,进一步阐述了NMR联用技术的发展现状,展望了其在枯草芽孢杆菌抗菌物的结构鉴定方面的应用前景。     

5-aza—dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究5-aza—dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20nM（72h）5-aza—dc和50nM（12h）TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-ttZa—dC＋TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-azaLdC＋TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率（P〈0．01）。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza—dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。