离体培养条件下半夏叶柄形成珠芽过程中内源激素的变化

为了探讨半夏试管珠芽形成的生理生化机制,以半夏无菌叶柄为材料,倒置在MS基本培养基上,对半夏珠芽形成过程中5种内源激素(IAA、GA3、ABA、ZR、JA)的动态变化进行了研究。结果表明:倒置半夏叶柄的珠芽无一例外地出现在叶柄形态学上端;ELISA方法测定显示,半夏叶柄形成珠芽的过程中叶柄上端IAA、ABA、ZR和JA的含量呈上升趋势,GA3在的珠芽形成初期急剧下降。随着珠芽的形成,GA3与其它各激素的平衡关系发生变化,IAA/GA3、ABA/GA3、ZR/GA3和JA/GA3的比值先呈下降趋势,15 d后开始上升;在珠芽快速形成期(10~20 d)IAA/GA3、ABA/GA3和JA/GA3维持在高的水平,其中JA/GA3的比值20 d后又呈上升趋势。     

基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

大口黑鲈肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性位点的筛选及其与生长性状关联性分析

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术对大口黑鲈肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全序列进行了SNPs位点筛选和分型,共筛选到2个单核苷酸多态性(SNPs)位点(C-1453T和T+33C),其中C-1453T位于启动子E8 box和Octamer(＋)调控元件之间的区域,T+33C的突变位于第一外显子区域,属于同义突变,氨基酸没有发生变化;利用一般线性模型分析单标记位点与大口黑鲈生长性状(体重、体长、体高、体宽和眼间距)相关性,均未达到显著水平(P>0.05)。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,双倍型D2在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均高于其它双倍型,而双倍型D5在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均低于其它双倍型,双倍型D2与D5之间在5个主要生长性状均存在差异显著(P＜0.05),推测双倍型D2对生长性状起正相关,而双倍型D5与大口黑鲈的生长性状呈负相关,因此推断MSTN基因突变位点双倍型D2与D5可作为大口黑鲈生长性状的两个标记位点,用其分子标记位点来辅助大口黑鲈育种工作以期加快育种进程。     

三疣梭子蟹FAMeT基因克隆及其在蜕皮周期中的表达水平

法尼酸甲基转移酶(farnesoic acid O-methyl transferase, FAMeT)是甲基法尼酯(methyl farnesoate, MF)生物合成途径中最后一步的关键酶,MF是一种类似昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)的倍半萜,在甲壳动物的生长发育及繁殖过程中起到了重要作用。本文克隆得到了三疣梭子蟹FAMeT的全长cDNA序列（GenBank登录号：KC192659）,它包括一个201bp 的5非编码区、一个318bp的 3非编码区,和一个825bp的开放阅读框（ORF）,编码274个氨基酸;推导的氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物FAMeT进行比对,发现一致性达75%-97%,其中与远海梭子蟹FAMeT的一致性最高;而且该氨基酸序列由两个CF（CPAMD8/FAMeT）区域组成,这两个CF区域是FAMeT的标志,在所有甲壳动物的FAMeT里均有发现,因此推导的氨基酸序列是三疣梭子蟹FAMeT基因。我们运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法分析了其在不同组织中、不同蜕皮周期中的表达量变化,发现FAMeT在三疣梭子蟹的各个组织里均有表达且在胸神经节(Taoracic ganglia)里表达最强;在三疣梭子蟹蜕皮过程中,大颚器FAMeT在D1期表达最强,然后逐渐下降至D4最低。该结果表明FAMeT在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要的作用。     

低温对罗非鱼基因组DNA甲基化的影响

以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼耐寒品系为实验材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析方法从全基因组水平上探讨了低温适应对罗非鱼DNA序列中CCGG位点的甲基化水平的影响。结果显示,选用的18对选择性扩增引物共检测到849个位点。耐寒品系检测到的位点数为411个,对照组为438个,其中发生甲基化的位点数分别为72和104个,总甲基化率分别为17.52%和23.74%;全甲基化位点分别为37个和65个,全甲基化率分别为9.00%和14.84%;半甲基化位点分别为35个和39个,半甲基化率分别为8.52%和8.90%。结果分析表明,尼罗罗非鱼耐寒品系的总甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平较对照组均有一定程度的下降。与对照组相比,尼罗罗非鱼耐寒品系基因组DNA甲基化总体水平下降了6.22%,其中以全甲基化位点变异为主,其下降幅度比例明显,为5.84%。由此可见,经过连续多代的低温胁迫可导致尼罗罗非鱼DNA甲基化水平发生改变,发生了去甲基化反应,表现为基因组甲基化程度降低的特征,说明了DNA甲基化与罗非鱼抗寒性反应密切相关。     

星斑川鲽MHCⅡ恒定链Ii基因的克隆和表达特性

为了研究星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用及调控机制,实验通过SMART-RACE技术克隆得到了星斑川鲽MHCⅡ恒定链(MHCⅡIi)的全长cDNA序列,其长度为1766 bp,包含135 bp的5′非编码区、837 bp的开放阅读框和794 bp的3′非编码区。该基因共编码279个氨基酸。理论分子量为30.848 ku,等电点为6.89。与已知物种MHCⅡIi进行同源性比对,结果与狼鲈、紫红笛鲷和鳜关系较近,同源性均为79%。利用quantitative realtime PCR(qRT-PCR)技术检测了MHCⅡIi在星斑川鲽不同组织中的表达,以及爱德华氏菌感染前后对该基因在不同组织中表达水平的影响,结果显示:在脾脏、头肾、肝脏、后肠、性腺、心脏、血液、鳃和肌肉组织中,MHCⅡIi mRNA均有表达,但在表达量上有明显差异,脾脏和头肾组织相对表达水平较高,鳃、血液、肌肉、心脏和性腺中的表达水平较低。病原感染后,免疫相关组织脾脏和头肾的表达水平升高最明显,肝脏和后肠的表达水平也略有升高,但变化不明显。本研究可为星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用机理提供理论依据,同时为海水养殖鱼类的抗病遗传育种工作提供研究基础。     

盐度对大连紫海胆生长发育的影响

大连紫海胆是产于西北太平洋沿海水域的一种重要经济海胆,也是我国正在研究发展的新的海水增养殖种类。为搞好其人工育苗与培养殖技术,探讨主要环境因子对其生长发育的影响是必要的。廖玉麟(1982)、廖承义(1987)、今井利为(1986)、伊东义信(1987)、Fuji(1962)等曾就温度和饵料这两个重要环境因子对海胆类的影响进行过研究,研究的对象包括大连紫海胆、马粪海胆Hemicentrotus pulcher-     

黑龙江茴鱼胚胎的发育及仔、稚、幼鱼的生长

采用Bouin氏液固定、剥离卵膜的方法对黑龙江茴鱼(Thymallus arcticus grubei Dybowski)的胚胎发育及孵出后仔鱼卵黄囊的吸收情况进行了观察,同时测定65日龄内的仔、稚、幼鱼生长状况。结果显示:黑龙江茴鱼卵是典型的端黄卵,其卵裂方式为盘状卵裂。胚胎发育可分为22个期,包括受精卵、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期、多细胞期、囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期、原肠早期、原肠中期、原肠晚期、神经胚期、胚孔封闭期、眼囊出现期、胸鳍芽出现期、晶体出现期、眼色素沉积期、循环期和出膜期,至发眼(晶体出现期)需75.84℃.d,至破膜需117℃.d;受精卵膜较鲑科鱼类薄而柔软,胚体头尾绕卵黄囊超过一周,晶体出现在眼色素沉积期之前;仔鱼卵黄囊的体积随着日龄的增加而逐渐减小,4日龄前吸收较快,此后吸收相对较慢;仔鱼在240℃.d(11日龄)左右时出现鳔并开始上浮,260℃.d(16日龄)左右时开口;积温达到346.9℃.d(20日龄)时卵黄囊完全被吸收,仔鱼期结束,进入稚鱼期;稚鱼在36日龄之前生长相对较缓慢,在36日龄后增长较快;在积温达到546.3℃.d(38日龄)时,稚鱼奇鳍褶开始退化,进入幼鱼期。     

鳙中焦磷酸盐水解酶的初步研究

本文采用离子色谱方法检测添加的焦磷酸四钠（TSPP）在新鲜碎鳙鱼肉中所发生的水解过程,并研究了焦磷酸盐水解酶（PPase）粗酶的特性。研究结果表明,添加到新鲜碎鳙鱼肉中的TSPP能被水解为单磷酸（Pi）;鳙鱼鱼肉中存在PPase,并且是水溶性蛋白。PPase粗酶水解TSPP的最适温度为50 ℃,最适pH为8.0。Mg2+、Mn2+和Co2+均可以激活PPase,但是Mg2+激活酶能力最强。Mg2+浓度为1mol•L-1时,PPase活性达到了0.023μmol•min-1•mg-1,显著高于其他两种金属离子的激活作用。葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）能够强烈抑制PPase活性;EDTA-Na2在浓度小于1 mol•L-1能激活酶,但浓度大于1 mol•L-1时却能够强烈抑制PPase活性。     

虹鳟IL-17多克隆抗体的制备及初步鉴定

本研究根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟Oncorhynchus mykiss头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增IL-17成熟肽基因,测序结果表明所获得的序列与发表序列相一致。将该基因重组至原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明:目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为32k Da,重组蛋白经Ni-NTA系统纯化、复性后纯度达90%以上,以其免疫小鼠制备虹鳟IL-17多克隆抗体。ELISA结果显示其效价为1∶25 600,而间接免疫荧光结果显示所制备的多克隆抗体能够特异性地识别真核细胞中瞬时表达的虹鳟IL-17。本研究成功制备虹鳟IL-17多克隆抗体,为下一步IL-17在虹鳟黏膜免疫中的作用及其佐剂效应研究奠定基础。