利用WGCNA进行玉米花期基因共表达模块鉴定

权重基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是系统生物学的一种研究方法,在挖掘生物学数据与特定性状之间的生物学关系方面具有十分重要的作用。本研究利用玉米(Zea mays L.)自交系B73的14份不同发育阶段的转录组数据,筛选掉低表达丰度的基因,最终得到了22,426个高表达的基因用于创建基因表达矩阵;利用不同组织作为性状,创建表型矩阵。然后利用R软件中的WGCNA包建立了共表达网络,共得到20个模块。本研究将与组织相关性高于0.65的模块定义为组织特异性模块,最终鉴定到14个组织特异性模块。利用在线网站Agrigo对组织特异性模块中的基因进行GO (gene ontology)富集分析,发现14个模块中均可以得到富集种类。开花作为玉米生育周期中的一个重要生理过程,不仅代表着植物从营养生长到生殖生长的转变,也关系到产量、株高和抗逆性等农艺性状。本研究发现8个组织特异性模块中的基因可以富集到与开花调控的代谢通路。此外,有17个已经报道过的开花时间调控基因存在于共表达模块中,并且主要分布在Blue模块和Darkmagenta模块,因此本研究重点关注了这2个模块内部的基因调控网络。本研究通过计算不同组织中的基因表达丰度,并联合权重基因共表达网络分析的方法,鉴定到了具有生物学意义的共表达基因模块,挖掘到了数个开花相关的模块,有助于揭示玉米开花调控的遗传机制。     

基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

基因敲除是研究真菌基因功能的重要方法之一,目前,丝状真菌敲除多采用基因两侧的同源臂对基因组的靶标进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究以稻瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建HPH-GFP(潮霉素-绿色荧光蛋白)融合表达载体; 2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段; 3)克隆上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段; 4)嵌合体片段转化真菌原生质体; 5)对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素HPH作为筛选标记外,还可用GFP作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。     

黑龙江省主栽水稻品种抗稻瘟病基因的分子检测与分析

了解品种本身的抗性基因型对于水稻品种合理布局具有重要意义。为了明确稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pik-m、Pi9、Pii、Pi-d3在黑龙江省水稻品种中的分布情况,选取34份主栽品种,利用这6个抗瘟基因的功能标记,对供试材料进行分子标记检测。结果表明,Pi9的分布频率最高,其次是Pi-ta和Pik-m,Pi-b和Pii抗性基因分布频率较低,Pi-d3的分布频率最低;供试的34份水稻材料中,被检测出最多含有5个抗性基因,而最少只含有1个抗性基因,含有2个抗性基因的品种所占比例最大,龙粳40和龙粳42不含有待检测基因。     

陆海高代回交群体抗黄萎病QTL定位

【目的】定位棉花抗黄萎病数量性状位点(Quantitative trait loci, QTL)。【方法】以海7124和TM-1配制抗感组合F1,再以鲁棉研28为轮回亲本构建的137个BC4F1家系为作图群体,筛选出多态性重复序列(Simple sequence repeat, SSR)标记,并与已发表的整合高密度遗传连锁图谱相比对,构建遗传图谱。采用复合区间作图法(Composite interval mapping,CIM)进行大田和病圃两个环境下抗黄萎病QTL定位。【结果】216个多态性SSR位点分布在26条染色体上,可覆盖棉花基因组3 380 cM(centi Morgan),标记间平均距离15.77 cM。定位到6个QTLs,分布在6条染色体上,可解释表型变异8.56%~20.26%,其中5个QTLs与前人研究结果相一致,在第1染色体上新定位到一个QTL。本研究可为分子标记辅助选择抗病育种提供帮助。【结论】定位到6个黄萎病相关QTLs,其中1个是在第1染色体上新发现的QTL。     

陆地棉衣分性状的主基因-多基因遗传分析

【目的】衣分是决定棉花产量的重要因素之一,有关其遗传研究相对较少,解析衣分性状遗传的特点,明确不同环境下衣分对产量形成的贡献机制。【方法】以国审优质棉中棉所70为基础构建的250个RIL(Recombinant inbred lines)群体,在黄河流域、长江流域和西北内陆棉区9个环境下对该RIL群体及其亲本进行了表型鉴定,并利用主基因+多基因混合遗传模型综合研究衣分性状遗传变化特点。【结果】母本s GK中156衣分性状在9个环境下均大于父本901-001,RIL群体衣分分布范围为33.91%～40.18%,平均为38.01%,表现为双向超亲,偏度和峰度绝对值都小于1.0,呈正态分布,变异系数为5.36%～8.17%;不同环境下衣分表现为西北内陆棉区>黄河流域棉区>长江流域棉区的趋势;遗传模型是以2～4对主基因或2对主基因+多基因遗传控制,主基因遗传率在1.26%～83.13%,多基因遗传率在27.35%～90.83%,主基因+多基因遗传率在92.00%～99.35%,一般情况下衣分是以2对主基因+多基因遗传为主,在2015年河南安阳、2016年河南安阳和2016年山东临清环境下以2～4对主基因遗传,遗传效应较高,在2015年河南安阳环境下最多检测到4对主基因的存在。【结论】衣分性状主基因+多基因遗传率大于90%,结果有助于进一步阐明优质棉中棉所70产量性状衣分的遗传特征,为不同生态区条件下相互引种和推广提供科学依据,为提高棉花产量、农民增收、QTL定位和高衣分品种选育提供理论基础。     

陆地棉无绒突变体miRNA的鉴定及其靶标基因分析

【目的】棉花纤维突起影响纤维的产量和品质,挖掘纤维起始相关的小RNA及其靶基因对于研究纤维起始机制至关重要。【方法】本研究以新乡小吉的野生型(Wild type,WT)及其无绒有絮突变体(Fuzzless mutant,FLM)开花当天的胚珠为材料,构建6个小RNA文库并进行高通量测序,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)基因组序列作为参考。【结果】共发现459个mi RNA,包括301个保守的mi RNA和158个新mi RNA。共得到13个差异表达的mi RNA,预测并分析了它们的靶基因。通过对靶基因的生物信息学分析结果显示,预测的这些靶基因侧重于编码HD-ZIP (Homeodomain-leucine zipper)、GRAS (Gibberellic acid insensitive,Repressor of GAI,Scarecrow)、AP2 (APETALA2)家族的转录因子,功能集中在转录和转录后调控阶段。对靶基因进行Gene Ontology (GO)注释发现,它们参与细胞分化、花药发育、花器官发育等生物学过程。随机选出4个mi RNA进行荧光定量PCR验证,结果证实了测序数据的可靠性。【结论】mi RNA通过负调控靶标转录因子和激素相关基因来影响纤维细胞的起始发育。     

转抗虫基因Cry1Iem大豆的分子鉴定与功能验证

通过转抗虫基因来提高作物的抗虫性是一条有效途径,以此来提高作物的产量和品质。本研究以转抗虫基因Cry1Iem大豆的T2、T3株系作为试验材料,利用常规PCR检测、Southern杂交、荧光定量PCR技术对转抗虫基因Cry1Iem株系进行分子鉴定;同时对40个转基因阳性株系进行室内人工接虫、200个转基因阳性株系室外网室接虫并进行抗虫性鉴定。选取其中10个株系进行常规PCR检测,结果在T2、T3当中都检测到了Cry1Iem、Bar、启动子CaMV35S、Nos目标片段,表明目的基因已被顺利导入受体JN28大豆植株当中并得到了稳定遗传;选取其中5个T2、T3转基因株系进行Southern杂交,结果显示:目的基因以单拷贝的形式整合到了大豆基因组当中;荧光定量PCR检测结果表明,Cry1Iem基因在选取的3个转基因株系中均得到了表达,而在非转化的受体JN28当中未检测到荧光信号。室内抗虫性鉴定结果显示40个转Cry1Iem基因株系豆荚内活虫的成活数量明显低于受体材料JN28大豆豆荚内的活虫数量,表明转基因材料具有显著的抗虫性。室外抗虫性鉴定结果表明:JN28大豆受体植株的虫食率为6.72%,属于感虫品种;而200个转Cry1Iem基因株系的平均虫食率为3.81%,属于抗虫品系。本研究结果为中国转基因抗虫大豆新品种的选育提供部分参考数据。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

紫斑牡丹种子发育期油脂合成积累的源汇基因协同表达

为研究紫斑牡丹种子油脂合成积累与相关基因(GPD1, DGAT1和DGAT2)表达间的关系,以四个不同发育期(6月20日, 7月7日, 7月17日和7月27日)的种子为材料,氯仿甲醇法测定种子含油率,实时荧光定量PCR方法分析基因的表达模式,分析相关基因在不同发育期种子中的表达差异及其对油脂合成积累的影响。结果表明:(1)不同发育期紫斑牡丹种子含油率呈不断升高趋势,在6月20日至7月27日的38 d内,从4.21%上升到18.38%;(2)调控油脂合成的源基因GPD1和汇基因DGAT1与DGAT2在发育前期的紫斑牡丹种子中的表达呈快速上升趋势,且表达量均在7月7日达到最高值;随后源汇基因的表达均不断降低。紫斑牡丹发育前期种子中源(GPD1)汇(DGAT1和DGAT2)基因的协同高表达,既促进合成了更多的TAG前体G3P,又促进了TAG积累。源基因GPD1表达量增加了2.44倍,汇基因DGAT1和DGAT2分别增加5.16倍和3.83倍,促成种子含油量增加了2.77倍。这可为深入理解紫斑牡丹种子油脂合成积累提供理论依据,对后续开展高油紫斑牡丹的分子育种具有重要意义。