两种外源二型硫酯酶TEII对链霉菌NRRL8165产生阿维菌素的影响

利用接合转移的方法将不同来源的二型硫酯酶(TEII,type II thioesterase)导入链霉菌S.avermitilis NRRL8165中构建了两种突变株,同时研究比较了两种突变株与野生型在等量发酵时阿维菌素产量的变化。结果表明:导入Tetrocarcin A的TEII突变株阿维菌素的产量提高了96.52%;导入氯丝菌素(Chlorothricin)的TEII突变株阿维菌素的产量提高了38.06%。进一步验证了TEII对聚酮类次级代谢产物的生物合成具有编辑和纠错功能。     

防治西葫芦和黄瓜白粉病的生物制剂的筛选

瓜类白粉病是蔬菜上的重要病害之一,为加大对该病害的生物防治力度,本研究采用课题组研发的1×109cfu/g玫瑰黄链霉菌水剂和10亿芽胞/g枯草芽胞杆菌悬浮剂以及市场上常用的枯草芽胞杆菌、哈茨木霉菌、寡雄腐霉、武夷菌素、多抗霉素等多种生物制剂进行田间药效试验,比较几种生物制剂的防治效果。结果表明,供试生物制剂对西葫芦白粉病的防效为57.65%~84.98%,其中3%多抗霉素水剂600倍液的防效最好,为84.98%,且具有明显的促生长作用,增产率达12.65%。其次为1 000亿芽胞/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂(武汉天惠)400倍液、2%武夷菌素水剂600倍液和3×108 cfu/g哈茨木霉菌可湿性粉剂300倍液,可作为西葫芦白粉病防治的选用药剂。1×109 cfu/g玫瑰黄链霉菌水剂对西葫芦和黄瓜白粉病均具有较好的防效,分别为78.68%和73.59%,具有开发和应用的市场价值。     

几个常用内参基因在淀粉酶产色链霉菌1628抗药性突变株中稳定性的评估

淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628是一株重要的生防菌株,其代谢产物对多种植物病原真菌具有较强的抑制效果。为了筛选在其不同抗药性高产突变株中均能稳定表达的内参基因,选择16S rRNA、sigB、hrdB、thyA、gyrB和rpoA共6个常见内参基因,分别探究它们在野生型菌株、链霉素抗性突变株、利福平抗性突变株和巴龙霉素抗性突变株中的表达情况,并用geNorm软件和NormFinder软件对结果进行分析。结果表明,使用不同软件分析得出的最佳内参基因略有差异。geNorm软件认为在上述4株菌株中,表达最稳定的内参基因分别是gyrB、gyrB、thyA、rpoA;而NormFinder软件认为rpoA基因在所有菌株的表达都是最稳定的。利用平均等级的算法平衡两个软件的分析差异,最终确定rpoA基因为表达最稳定的内参基因。通过检测toyG基因的表达水平,发现以rpoA作为内参基因能得到更合理的结果。     

海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析

为获取全新来源并具有潜在高性能的海因酶,本研究通过对海洋沉积物进行以D-对羟基苯海因作为唯一氮源的选择培养基对潜在菌株进行初步筛选,然后通过双层琼脂法和微孔快速筛选法对初筛菌株进行复筛,并结合分子生物学筛选方法进行终筛,最终得到桔橙小单胞菌(Micromonospora aurantiaca,GenBank登录号:FJ547135.1)、金色链霉菌(Streptomnyces aureofaciens,GenBank登录号:AB326923.1)、桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii,GenBank登录号:GU238264.1)和链霉菌7-145(Streptomyces sp.7-145,GenBank登录号:JQ782979.2)4株产D-海因酶的阳性链霉菌.用兼并引物扩增4株阳性菌中的D-海因酶表达序列,转化大肠杆菌(Escherichia coli),并构建表达相应D-海因酶的工程菌株E.coli S1、E.coli S14、E.coli S29和E.coliS 145,提纯4种D-海因酶,并测定酶的酶活和动力学参数.结果显示,链霉菌7-145菌株中表达的海因酶活性最高,比活力为9.7 U/mg,催化速度常数Kcat=3.2x106/s,Km=9.5 mmol/L.最后利用Swiss-model软件对其进行在线同源模建和Caver Analyst软件对链霉菌7-145菌株来源的海因酶的催化通道进行结构模拟分析.模拟分析结果显示,本研究中D-海因酶的主要催化通道Tunnel 1长度为9.1(A),瓶颈氨基酸残基为59位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸,瓶颈半径为2.18 (A);潜在的催化通道Tunnel 2长度为13.6(A),瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶颈半径为1.52(A).如果对Tunnel 2通道中的62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸进行定点突变,有望开发出一种性能更优的D-海因酶.本研究提供了一种全新的海因酶阳性菌筛选体系,通过计算机模拟手段能够更直观了解海因酶的催化机制,为进一步获得性能更优的海因酶奠定基础.     

球孢链霉菌AM 6的液体发酵条件研究

以PD培养液为测定培养基,采用抑菌圈法测定了球孢链霉菌AM6在不同培养时间、pH值、温度、通气量下液体发酵产物时烟草赤星病菌孢子的抑制作用。结果表明,AM6在培养的第96～108h和132-156h时分别达到产孢、产素高峰期;pH9．0,28℃产素最高;通气量少有利于产素。     

蛋白质交联——絮凝沉淀法筛选产转谷氨酰胺酶放线菌株的效果分析

为寻找一种廉价、快捷的方法选育转：谷氨酰胺酶（MTG）菌株,采用平板稀释法分离土壤放线菌,根据转谷氨酰胺酶催化反应结果的特性,设计了一种蛋白质交联-絮凝沉淀性能测定方法对分离菌株进行复筛,用比色法测定MTG酶活,并用插片法进行复筛菌株的初步鉴定。结果表明：从土壤中分离出16株放线菌,经复筛后有6株放线菌产生沉淀,即具有MTG酶活性,且其中LH-011的MTG酶活最大,达0．76u·mL^-1.经初步鉴定,6株放线菌均属于放线菌科链霉属。可见,用蛋白交联-絮凝沉淀性能测定的方法可以筛选出产MTG菌株。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物roflamycoin的光稳定性分析

为研究影响玫瑰黄链霉菌Streptomyces roseoflavus Men-myco-93-63活性代谢产物roflamycoin光不稳定的因素,采用高效液相色谱仪测定了不同光照环境、光照强度、光照时间、溶剂、质量浓度等因素下roflamycoin的光分解率;检测8种光稳定剂对roflamycoin光分解的抑制作用;并通过抑菌圈法测定了光分解前后物质抑菌效果的变化。结果显示,在roflamycoin的光分解过程中,太阳光和日光灯是其敏感光源,而紫外光并不能引起光分解;光照强度越大、光照时间越长、质量浓度越低,其光分解速率越快;在甲醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃5种溶剂中的光分解速率无显著差异;roflamycoin光分解过程最终可以达到一个稳定状态,主要分解为3种物质,并与roflamycoin具有相同的五烯大环内酯骨架;8种光稳定剂均未表现出抑制光分解的作用。roflamycoin光照分解后对12种病原菌仍有抑制作用,其中对番茄灰霉病菌、玉米穗腐病菌等6种病原菌的抑制活性显著增强,抑菌圈直径增大7.64%～21.91%,对棉花黄萎病菌、苹果斑点落叶病菌等4种病原菌的抑制活性显著降低,抑菌圈直径减小10.03%～91.46%。推测roflamycoin的光分解产物仍具有抑菌活性。     

新疆天池放线菌的分离及其抑菌活性

为了充分挖掘和利用新疆特色放线菌资源,开发新型微生物源农药,采用选择性分离方法对新疆天池放线菌进行分离,结合离体和活体试验筛选抑菌活性较高的放线菌,并利用形态学和分子生物学手段进行菌株鉴定。结果共分离得到213株放线菌,其中从天池草甸土中得到的放线菌数量最多,占40.38%;离体活性测定结果显示,有5株放线菌对立枯丝核菌和番茄灰霉病菌均具有较好的抑制作用;盆栽试验结果显示,放线菌TC-50对黄瓜立枯病的防治效果最高,为89.98%,并且可提高黄瓜种子的发芽率,促进黄瓜幼苗生长;经鉴定,放线菌TC-50属于链霉菌(Streptomyces sp.)。可见,链霉菌TC-50有望开发为具有新疆特色的微生物源农药。     

表面活性剂对加利利链霉菌AF1发酵的影响

【目的】研究表面活性剂对加利利链霉菌Streptomyces galilaeus AF1菌株发酵的影响。【方法】利用单因素试验优化表面活性剂的添加种类、初步浓度及最佳添加时间,采用Box-Behnken试验和响应面分析对表面活性剂添加质量浓度进行组合优化。流式细胞仪测定细胞荧光强度,确定表面活性剂对AF1菌株细胞膜的影响。【结果】表面活性剂的最优添加质量浓度:吐温–80为8.95 g·L~(–1)、曲拉通X–100为2.09 g·L~(–1)、山梨醇为3.89 g·L~(–1),最优添加时间为接种后5 d;细胞膜透性测定结果表明,试验组的AF1菌株细胞荧光强度极显著高于对照组。【结论】试验得到的响应面模型对因变量的解释程度达94.89%,具有实际意义;添加最优表面活性剂组合后,加利利链霉菌AF1的细胞膜通透性极显著增大,间接导致胞内活性物质的外排量增加,提高了抗菌活性物质的生物合成量。     

一株具有抗菌活性的水浮莲内生放线菌的鉴定

[目的]从水浮莲(Pistia stratiotes L.)中分离获得对动植物病原菌具有拮抗活性的内生菌,对其进行系统鉴定及特性分析.[方法]采用纸片法进行拮抗实验,并对其形态特征、培养特征、生理生化特征进行检测分析, 16SrDNA序列的PCR扩增.[结果]筛选得到1株具有拮抗特性的放线菌XJPL-LA-67,该菌株的上述几个特征与链霉菌Streptomyces griseorubens的高度一致,与此同时,依据其16SrDNA序列分析,XJPL-LA-67序列的同源性与Streptomyces griseorubens高达99;.[结论]将水浮莲内生放线菌XJPL-LA-67确定为链霉菌Streptomyces griseorubens.