东北地区大豆花叶病毒3号株系衣壳蛋白的表达、纯化及单克隆抗体制备

本研究克隆了东北大豆花叶病毒3号株系衣壳(CP)蛋白基因,在大肠杆菌中表达了CP蛋白,通过亲和层析获得了纯化的CP蛋白;制备了9株CP蛋白单克隆抗体,中和试验表明,6E7、2D3、1C2这3株单克隆抗体具有中和作用,能够阻断病毒的感染。本研究制备的单克隆抗体为大豆花叶病毒检测试剂盒的研制和大豆花叶病毒抗病育种研究打下基础。     

进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测

【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L^-1、SMV 0.4 μmol·L^-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10^-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10^-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

种子带毒率及有翅蚜降落量对SMV流行的影响

大豆田主要迁飞降落的蚜虫有大豆蚜、棉蚜、玉米蚜、桃蚜、禾谷缢管蚜、豆蚜等,而大豆蚜的数量占绝对优势。当有翅蚜迁飞降落量大,同时田间病株率高时,SMV日侵染率高,最高达49.57%。田间有翅蚜发生和迁飞降落高峰一般在7月份,此时的迁飞降落蚜量和SMV的种子带毒率决定病害流行的程度。0.5%种子带毒率显著推迟SMV流行的时期。田间有翅蚜发生和飞翔高峰期推迟到8月份,0.2%和0.1%种子带毒率可控制SMV的流行为害。     

大豆花叶病毒介体迁飞动态测定方法——绿色诱盘的设计和应用研究

设计与大豆叶片反射光谱相似的绿色诱盘,诱集大豆田迁飞降落的有翅蚜,结果所获蚜虫种类和数量与田间有翅蚜的动态变化相吻合。绿色诱盘诱集蚜量与田间百株有翅蚜量和大豆花叶病(SMV)侵染速率相关显著。黄皿诱蚜量接近绿色诱盘所获蚜量的2倍,但黄皿诱蚜与田间百株有翅蚜量和SMV侵染速率均无显著相关。SMV流行程度与田间百株有翅蚜量无显著相关,而决定于田间种传病株率的高低和病害盛发期田间着落蚜量的大小。     

大豆对SMV SC-7株系群的抗性遗传与基因定位

科丰1号×南农1138-2的P₁、P₂、F₁和180个重组自交家系接种SC-7株系群的鉴定表明,P₁与F₁全抗,P₂全感,说明抗性为显性;重组自交家系抗、感按1∶1分离,说明抗性由一对基因控制。利用王永军等的遗传连锁图对SC-7株系群的抗性基因进行连锁分析,将抗病基因Rsc-7定位于N8-D1b＋W连锁群上,并与已定位的5个抗性基因中的3个连锁,还有一个与之相连锁的标记LC5T,其排列顺序和遗传距离为Rsa (30.6 cM) Rsc-7 (22.1 cM) Rn3 (10.3 cM) Rn1 (15.8 cM) LC5T。     

不同抗性大豆品种(系)感染SMV后可溶性糖和游离氨基酸的研究

大豆品种感染ＳＭＶ后,感病植株各生育阶段（Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５）单株可溶性总糖含量明显低于健株,叶片中总游离氨基酸含量明显增加。表明：ＳＭＶ的侵染抑制了大豆碳水化合物的代谢,而促进行了氮化物的代谢合成各种氨基酸,以利于ＳＭＶ的复制与增殖。天门冬氨酸（ＡＳＰ）、异亮氨酸（ＩＬｅ）、苯丙氨酸（ＰＨｅ）、组氨酸（Ｈｉｓ）在感病品种中含量的显著增加,是大豆植株感病的又一生化症状。     

转ipt基因大豆感染SMV1号的生理特性变化

本文对黑龙江省推广的三个大豆品种及它的ｉｐｔ基因株系Ｆ４,采用生化技术酶联免疫检测技术（ＥＬＩＳＡ）研究了病毒病侵染条件下,转基因植株的生化特性变化及内源激素含量及其人平衡状况的影响,实验结果表明,ＳＭＶ１号诱导条件下,转基因大豆细胞中ＭＤＡ含量减少,ＳＯＤ酶活性较强,转７ＳＬ－ｉｐｔ基因的大豆,内源激素ＩＰＡ,ＩＡＡ,ＧＡ含量明显增加,而转８ＳＬ－ｉｐｔ基因的大豆,则通过内源激素ＩＡＡ,ＡＢＡ含     

春播抗SMV鲜食大豆新品种‘苏奎2号’的选育及栽培技术

旨在选育抗SMV且熟期适中的高产春播鲜食大豆新品种。江苏省农业科学院豆类作物研究室利用具有优异抗性材料‘0118-1-1-2’和‘辽鲜1号’进行杂交,进行了多年多点抗性鉴定和产量、品质等性状选择,最新选育出抗SMV鲜食春大豆新品种‘苏奎2号’。该品种具有较好的丰产性和食用品质,并抗大豆花叶病毒南方流行株系SC3和SC7,适合江苏省春播种植。‘苏奎2号’于2016年6月通过江苏省农作物品种审定委员会审定(证书编号2016-1-16)。     

重组型大豆花叶病毒河北分离物序列特征及侵染性

重组型大豆花叶病毒(recombined soybean mosaic virus,SMV-R)是一种新SMV类型,在我国多个大豆产区广泛流行。本研究对一个重组型SMV河北分离物(HB-RS)进行全基因组测序,比较与非重组型SMV在侵染4个大豆品种后病毒浓度积累的差异。结果显示,除poly-A尾巴外,HB-RS(NCBI登录号为KR065437)由9993个核苷酸组成,包含一个开放阅读框(open reading frame,ORF),翻译后形成3202个氨基酸,系统进化分析结果显示HB-RS分离物与另外两个重组型SMV分离物聚在一组。抗性鉴定结果显示,4个品种对HB-RS和Sc6平均病情指数分别为59.5和60.5,相同大豆品种对不同的株系(分离物)可能呈现不同的症状和抗性表现,其中冀豆17对Sc6和HB-RS分别表现高抗和中抗,表明大豆对SMV的抗性存在一定的株系(分离物)专化性。此外,HB-RS在4个品种中的浓度积累均高于Sc6,在南农1138-2病毒浓度最高,达522 U,其次为五星1号(471 U)和冀黄13(199 U),最低为冀豆17,仅90 U。说明HB-RS在寄主体内更具有生存适应性,不同品种对SMV存在抗性差异。冀豆17可作为抗性品种和亲本进一步推广。