Establishment of Digital RT-PCR Assay for Detection of Swine Influenza Virus H3N2 Subtype

A new assay for the detection of swine influenza virus (SIV) was developed with a novel nucleic acid probe——Molecular beacon in this study. The specific primers and molecular beacon probes were designed according to the conserved region of H3 and N2 genes of SIV H3N2 subtype. A digital RT-PCR assay was developed for detection of SIV H3N2 subtype. The results showed that SIV H3N2 subtype could be identified simultaneously on this microarry with high sensitivity and reproducibility,which could reach to 10⁶ dilute viruse. The conclusion was that the digital RT-PCR method could analyze quantitatively the RNA templates.On the identification of H3N2 SIV,the digital RT-PCR method was much more scientific than Real-time quantitative PCR method.     

猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法的研究

以猪附红细胞体和多种血营养菌16S rRNA基因的保守区设计合成引物HM-f/HM-r,在反向引物的5′端用生物素标记,以猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的可变区序列设计种特异性寡核苷酸探针,探针的5′端用地高辛标记,成功地建立了猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法。通过测定不同浓度PCR产物对应的微孔板杂交-酶反应显色OD值,用SPSS统计软件进行回归分析,得到回归方程为y=2.1012-0.4492×logx,其相关系数R为0.977,显示对未知样品可进行定量检测。该方法与猪的多种细菌性病原、猫血巴尔通氏体CA株和E.wenyonii无交叉反应,其敏感性比常规PCR琼脂糖电泳检测提高了近100倍。用建立的方法对38份临床样品进行检测,结果有12份检测结果为阳性。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

玉米高直链淀粉基因ae的特异性PCR鉴定

根据ae基因序列设计21对引物,对4个常规玉米自交系和4个具有aeae纯合基因型的高直链淀粉玉米自交系及其杂交种进行特异性PCR鉴定。结果表明,引物8可将具有AeAe基因型的普通玉米自交系与具有aeae基因型高直链淀粉玉米区分开来,为将普通玉米自交系快速改良成高直链淀粉玉米自交系提供了一种有效的分子标记检测技术。     

基因探针和PCR对鲤吉陶单极虫的检测

采用液氮冷冻研磨法破碎吉陶单极虫（Ｔｈｅｌｏｈａｎｅｌｕｓｋｉｔａｕｅｉ）孢子，按常规法提取其基因组ＤＮＡ。取ＤＮＡＥｃｏＲＩ消化产物，采用低熔点琼脂糖回收法制备大（３．０～１５．０ｋｂ）、小（０．５～３．０ｋｂ）片段，将其克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｋｓＥｃｏＲＩ位点，经α－互补现象、酶切鉴定和虫体ＤＮＡ生物素标记探针筛选，构建了含２３个克隆的基因文库，克隆片段介于０．９～６．８ｋｂ之间；经阳性克隆标记筛选及特性分析，制备了长度为０．９ｋｂ（１９号质粒克隆片段）的探针，该探针具有较强的敏感性和特异性。对该探针两端ＤＮＡ序列进行分析，设计出１对引物。上游引物序列为：５′ＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＣＡＡＧ３′，下游引物序列为：５′ＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧ－ＴＡＴＣＧＣＴＧＣ３′。应用该对引物对虫体进行了检测     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌8种毒力基因的PCR检测

为研究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)主要毒力因子的分布情况,本试验利用PCR对70株临床型乳房炎、55株隐性乳房炎金黄色葡萄球菌的8种主要毒力基因进行检测。结果显示,nuc、ClfA、TSST-1、PVL、Hla、Hlb、FnBPA和FnBPB 8种毒力基因在临床型乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(70株)、100.0%(70株)、0(0株)、5.7%(4株)、100.0%(70株)、11.4%(8株)、97.1%(68株)和100.0%(70株);在隐性乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(55株)、100.0%(55株)、0(0株)、70.9%(39株)、98.2%(54株)、9.1%(5株)、100.0%(55株)和100.0%(55株)。结果表明,nuc、ClfA、Hla、Hlb和FnBPA 5种毒力基因是引起奶牛乳房炎的SA的最主要毒力基因;PVL基因可能是引起隐性乳房炎的重要致病基因。     

猪链球菌2型四川分离株猪体回归试验

选用35~38日龄的健康断奶仔猪21头,分3组,用2005四川分离株SSsc0501分别经静脉、肌肉注射和口服3种途径感染,进行猪体回归试验。肌肉注射组(含菌0.6×108个/mL)16 h开始出现症状,至36 h全部死亡,发病率、病死率均为100%;静脉注射组(含菌0.2×108个/mL)25 h开始出现症状,48 h内全部死亡,发病率和病死率均为100%;口服攻毒组(含菌2×108个/mL)90 h后开始有发病症状,第9天有1头死亡,发病率75%,病死率33%。从感染病死猪的肝脏、脾脏、肾脏、心血、大脑、脑脊液、淋巴结、肺脏和关节液中均分离到链球菌,经鉴定为试验攻毒的目的菌,表明猪体能够很好地用于猪链球菌2型动物感染模型,同时说明该菌侵害器官广泛,为进一步探讨该病的综合防制提供了重要技术依据。     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

兽用疫苗支原体污染的PCR检测技术的建立及应用

根据支原体的16 S rRNA基因设计特异性引物,以兽用疫苗中常见的支原体DNA为模板进行PCR试验,优化反应体系,建立了兽用疫苗支原体污染的PCR 检测方法,并对市场上的兽用疫苗随机抽查检测,其检出率为24.4%(22/90)。结果表明该方法特异性强,灵敏度高,有望成为兽用疫苗支原体污染的检测方法之一。     

猪细小病毒PCR检测与分离研究

根据猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2基因序列,设计合成1对引物,建立了检测PPV的PCR方法。检测14份临床组织,检出阳性11份,阳性检出率为79.5%。阳性样品扩增产物用EcoRⅠ酶切得到了预期的结果,对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的PPV基因核苷酸序列比较,同源性达99%~100%,所编码的氨基酸同源性为93%~100%。从PCR检测阳性的一份病料组织中分离出1株PPV。试验证明,建立的PPVPCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床样品的快速检测。