植物数量抗病基因克隆及其抗性机理的研究进展

培育广谱、持久抗病的作物品种,不仅需要深入研究质量抗病性,而且需要更深入地洞悉数量抗病性的可能作用机理。而目前,人们对数量抗病基因的可能特征和数量抗病性的机理的认识还相当模糊,这在很大程度上限制了数量抗病基因在育种实践中的应用。本文首先综述数量性状座位（quantitative trait loci,QTL）的克隆策略和精确获取数量抗病性状值的方法;其次根据数量抗性座位（quantitative resistance loci。QRL）的相关研究进展,对QRL的可能特征进行一定的综述,认为部分QRL的抗性机理直接对应于R基因、抗病基因类似物（resistance geneanalogs,RGA）、防卫基因、防卫反应途径中的相关基因等在植物抗病性上的作用机理;最后,作者推测存在4种抗性特征的QRL,即小种特异性或非特异性QRL和“病原菌”特异性或广谱性QRL,并认为数量抗性持久性的遗传基础与这些不同特征的QRL间有着密切的联系。该综述将对QRL的候选基因分析和克隆、数量抗病机理研究和QRL的育种应用提供有益的参考。     

文冠果实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)性别分化过程研究和不同器官的内参基因,本研究以文冠果性别分化关键期的顶芽和侧芽、根、茎、叶、种仁、雌能花和雄能花为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)鉴定7个候选内参基因(Actin,UBQ,EF-1α,TUB,eIF-4α,18S rRNA和GAPDH)在各样品中的表达量,并评价7个基因的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同样品中的表达量存在明显差异,各基因在雌能花中的表达均显著高于其他材料,在雄能花中的表达处于较低水平;适用于文冠果性别分化过程的最优内参基因为UBQ和eIF-4α,适用于不同器官的最优内参基因为EF-1α和GAPDH。研究结果将对今后进行文冠果性别分化过程研究和不同器官中的基因表达分析提供参考。     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型毒株的基因序列设计了一对特异性引物P1/P2,扩增的片段为550bp,根据欧洲型毒株设计了一对特异性检测引物P3/P4,扩增的片段为433bp,建立PRRSV的RT-PCR的检测与血清型鉴别方法。特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA。敏感性试验表明,这2对引物可以分别到检测10-5TCID50和10-4TCID50的病毒含量。利用该方法对重庆、四川某些猪场中临床上疑似为PRRS的20份送检组织样品进行检测,只有引物P1/P2能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物;其中有15份样品呈PRRSV阳性结果,阳性率为75%,说明送检的样品感染的PRRSV为美洲型。试验结果表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,是临床上对PRRS进行快速诊断和分子流行病学调查的实用方法。     

水稻苗期生长特性的遗传剖析

 以1个水稻重组自交系为作图群体进行盆栽试验，分别在播种后第14、24、34和44天进行第1、2、3和第4次取样，考察秧苗苗高和干物重以及播种前所用种子的千粒重。结合1张高密度的遗传图谱，对性状进行复合区间作图，分别检测到控制秧苗干物重、苗高和种子千粒重的主效应QTL 6、14和3个。其中，位于3号染色体RM148-RM85区段的QTL qGC-3-3同时影响第4期干物重和第1、3和4期苗高，且其对苗高的效应呈逐期递增的趋势。与qGC-3-3相反，位于5号染色体RM163-RM161区段的QTL qGC-5 同时影响第1～3期的干物重和苗高，但其效应由强趋弱。在第1～4期中，秧苗干物重与苗高的相关系数分别为0.60～.70，为极显著（P<0.01）正相关。秧苗干物重和苗高与种子千粒重的相关性均呈逐期递减的趋势、以至于到后期相关性较弱或不显著。QTL定位结果表明，对种子千粒重效应最大的QTL正是上述5号染色体上的qGC-5，该QTL对这3个相关性状的效应方向均一致，但对秧苗干物重和苗高的效应大小是逐期递减。将本研究中定位到的QTL与已报道的利用同一定位群体所检测到的籽粒产量性状QTL相比较，发现有的QTL（如3号染色体上的QTL qGC-3-1和qGC-3-3）尽管在水稻生育早期的效应较小，但其效应随着生育进程的发展而逐期递增，且加性效应的方向在全生育期一致；有的QTL（如5号染色体上的qGC-5）在水稻生育早期的效应相对较大，但其效应逐期减弱，以至于对生育后期的生长发育和产量性状没有直接影响或影响很小。这些QTL的表达具有较强的时期特异性。     

多重RT-PCR快速检测禽流感病毒的研究

参考H1-H15亚型禽流感病毒(AIV)的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因,共设计4对引物,建立了2对引物扩增AIV的NP、HA基因的多重RT-PCR方法.应用此法分别对H5、H6、H9亚型AIV尿囊液RT-PCR,电泳,回收预期片段进行测序,并同Genebank的注册序列进行同源性分析.也对NDV、IBV、IBDV尿囊液以及3种亚型AIV尿囊液的2倍系列稀释样品进行检测.结果表明,3种亚型AIv尿囊液均出现2条特异性条带,经测序确证为目的扩增片段,BLAST的同源性初步判断3种AIV的亚型为H5N1、H6N2、H9N20对NDV、IBV、IBDV的RNA扩增未见2条目的条带,判断为阴性,说明该法特异性强:能对3种亚型AIV尿囊液64～128倍稀释的样品检测出AIV,表明其灵敏度高.该检测法检测的整个过程仅需4h,实现了AIV的快速检测.     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR诊断方法的建立

利用分子生物学方法,选择禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及传染性支气管炎病毒的N基因,分别在基因序列的保守区域设计1对特异性引物,利用所合成的3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增,在优化单项RT-PCR条件的基础上,建立禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR的检测方法,同时对该检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这3对引物分别能特异性地扩增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及传染性支气管炎病毒的N基因片段,大小分别为385 bp、520 bp和748 bp,初步建立了快速、敏感、特异鉴别检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒的分子诊断方法。     

草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定

 【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。     

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.     

实时荧光定量PCR构建奶牛生殖系统PrP基因标准品质粒和标准曲线

为阐释PrP基因在奶牛生殖系统的正常表达和正常的生理功能,以及为确定生殖系统在疯牛病垂直传播中的地位和其分子机理奠定基础,采用实时荧光定量RT-PCR的方法构建了奶牛生殖系统PrP基因的标准质粒和标准曲线。对含有目的基因质粒的EcoRⅠ酶切鉴定表明所插入的片段大小为302 bp,与预期的结果一致。所构建的标准曲线的相关系数r2=0.999,系统生成的回归方程为y=-0.29x 9.48,说明成功构建了奶牛生殖系统PrP基因的标准质粒和标准曲线,为研究PrP基因在奶牛其他组织的定量奠定基础。