东北虎巴氏杆菌毒力基因toxA的克隆及同源性分析

通过对吉林市江南公园送检东北虎病例的病原分离鉴定,分离出多杀性巴氏杆菌,为进一步加强对该病的流行病学调查,并为准确诊断和治疗该病提供依据,实验对该株巴氏杆菌毒力基因toxA进行了研究。根据巴氏杆菌毒力基因toxA序列设计合成1对引物,以临床分离的虎源巴氏杆菌为模板,通过PCR技术,扩增出toxA基因片段。将长约526bp的toxA目的基因克隆到pGEM-T载体上,通过核苷酸序列测定,结果表明toxA基因序列与发表序列(X51512)的同源性为100%。流行病学调查显示,东北虎巴氏杆菌病的病原可能来自其食物(牛、羊肉等)。因此,在饲养过程中应加强检疫,切断巴氏杆菌病食源性传播途径。     

黄瓜抗病基因类似序列( RGA) 的同源性分析和Southern鉴定

 使用ClustalW和DNAMAN 3.0分析了本实验室克隆的15个黄瓜抗病基因类似序列(RGA)之间以及与烟草的N 基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因之间的同源性, 并对这些RGA进行了PCR和Southern验证与分析。结果表明: 15个黄瓜RGA中, 核苷酸序列同源性最高的是CsRGA2、CsRGA4和CsRGA5, 其次是CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和CsRGA9, CsRGA1和CsRGA3也存在较高的同源性; 其余的RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与N、L6和RPS2等抗病基因的产物之间同源性最高46% , 最低22%。根据核苷酸序列设计了15对特异引物, 用PCR方法验证了所有黄瓜RGA的存在, 其中CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物PCR方法合成了15个黄瓜RGA的地高辛探针, 与EcoRⅤ酶解的黄瓜‘215’、‘129’和‘L18’的基因组DNA进行Southern杂交, 证实了各个RGA在基因组上的存在, 同时发现, CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝,CsRGA3是单拷贝, 其余为双拷贝。     

四个新城疫病毒强毒株HN基因的同源性分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）四平株、昌黎株、青岛株、Ｆ４８Ｅ８株分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚增殖，蚀斑纯化（３代），生物学特性鉴定及结合基因序列分析，表明ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株均为强毒株。经差数、蔗糖密度梯度离心提纯病毒，分别提取ＲＮＡ，利用一对特异性引物及ＲＴ－ＰＣＲ方法，一次性扩增出 ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株和 Ｆ４８Ｅ８株的全长 ＨＮ基因，分别将该ＨＮ基因克隆入载体ｐＫＳ（－）并进行测序。序列分析表明，这４个毒株ＨＮ基因核苷酸长度均为１７１３ｂｐ，编码５７１个氨基酸，其中四平株和 Ｆ４８Ｅ８株含有５个糖基化位点，青岛株和昌黎株含有 ６个糖基化位点，四平株含有 １２个半胱氨酸残基，而昌黎株、青岛株和Ｆ４８Ｅ８株含有１３个半胱氨酸残基。３个野生毒株与Ｆ４８Ｅ８相比较，核苷酸序列同源性为８５．７％－９９．３％，推导的氨基酸序列同源性为 ８９．５％－９８．８％，其中 ＮＤＶ四平株与标准强毒 Ｆ４８Ｅ８同源关系最近，核苷酸同源性为 ９９．３％，推导的氨基酸同源性为 ９８． ８％。     

马流感病毒(A/equine/Qinghai/1/94)核蛋白基因的序列测定及同源性分析

根据已发表的马流感病毒核蛋白基因序列，设计并合成一对特异性引物，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）成功扩增出了我国马流感病毒（A/equine/Qinghai/1/94核蛋白基因。将该片段连接到PGEM-T-EASY载体并转化DH5α，提取阳性菌落的质粒径EcRo1酶切的PCR鉴定其大小为1.5kb左右，对其测序并进行分析发现，与A/Equine/Kentucky/2/86,A/Equine/Miami/1/63等关系较近，同源率为93.3%--93.4%，而与我国马流感吉林A/Equine/Jilin/1/89株关系较远，同源率仅为84.6%。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株S1基因序列测定及同源性分析

通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株（SY株）的免疫原S1基因cDNA，将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点中，测定插入片段核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。序列分析表明，SY毒株S1基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H120、N1-62、Gray、6/82、Ark99等毒株的同源百分率都低于80%。     

应用计算机进行BT—ICP基因的分类和同源性比较

本文应用DNASIS(V7.12)和PROSIS(V7.12)软件、GenBank(1994.8,Releasee 84.0)和Swiss—Prot(1994.2,Releasee 28.0)数据库对苏云金杆菌(Bacillus Thuringiensis,BT)杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)及其编码基因进行了检索,在此基础上对ICPs基因序列结构的同源性、DNA片段总碱基数、晶体蛋白氨基酸数及分子量、晶体蛋白基因编码序列(CodingSequence,CDS)范围、目标生物等进行了比较,发现属同一基因型的不同菌株来源的晶体蛋白基因编码蛋白区的序列几乎完全一样,同源性高达99％,而不同基因型编码的蛋白氨基酸序列则差异较大。文中根据上述资料对100个苏云金杆菌晶体蛋白基因进行归类,将之分为cryⅠ——cryⅧ、cytA、cytB等10类36个亚类,还对晶体蛋白基因分类的有关问题进行了讨论。     

枯草芽孢杆菌群β-甘露聚糖酶基因克隆及同源性分析

本文对33株枯草芽孢杆菌群菌株进行β-甘露聚糖酶活性筛选,其中的32株具有β-甘露聚糖酶活性,只有1株无β-甘露聚糖酶活性。通过基因克隆测序的方法获得33株枯草芽孢杆菌群菌株β-甘露聚糖酶基因编码区全序列,对酶基因进行同源性分析并构建系统发育树;在β-甘露聚糖酶基因系统发育树中,33株枯草芽孢杆菌群菌株聚为3个分支,分别是枯草芽孢杆菌分支、地衣芽孢杆菌分支和解淀粉芽孢杆菌分支;枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因种内同源性大于91％,而种间同源性为60％～69％。     

产毒微囊藻PCR检测方法的建立

[目的]建立产毒微囊藻的PCR检测方法。[方法]根据GenBank上发表的mcyA基因序列保守区域设计一对引物,建立和优化检测产毒微囊藻的PCR方法,并以此方法检测产毒和非产毒微囊藻参考株系。[结果]经PCR检测,产毒藻株出现特异性扩增条带,而不产毒株未出现特异性条带;以10倍系列稀释纯培养的蓝藻细胞作为PCR反应的模板,检测限均为2.46×103细胞/ml;运用建立的方法从天然水体中检测到了产毒微囊藻,对PCR产物序列进行比对,发现PCR扩增片段与铜绿微囊藻(PCC7806)核苷酸序列的同源性为98%。[结论]该研究为水华产毒微囊藻的监测提供了一种新方法。     

禽流感分离株GD/1/96(H5N1)非结构蛋白结构建模

为预测H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白全长结构,本研究以A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株NS1蛋白氨基酸序列为目标序列,通过同源建模以及蛋白质结构叠合预测出NS1蛋白全长单体以及二聚体初始结构,采用约束分子动力学方法对初始结构进行优化,并利用立体化学、折叠可靠性、残基包装质量等评判方法对优化后的模型进行评估。结果表明所建立的NS1蛋白全长单体及二聚体结构模型具有很高的可信度,可用于基于结构的功能研究及虚拟筛选等工作。