口蹄疫疫苗的悬浮培养工艺研究

通过生物反应器中进行BHK21细胞悬浮培养并逐级放大,分别接种口蹄疫OJMS/2000株与Asia 1/JSL株,纯化灭活后制备50批疫苗,结果均符合《口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价疫苗(OJMS株+ JSL株)制造及检验规程》（以下称规程）所规定的各项标准,病毒146S抗原含量比转瓶培养提高10倍以上、疫苗的不良反应得到进一步改善.     

口蹄疫双佐剂灭活疫苗的研究

在口蹄疫二价灭活疫苗（O型、AsiaⅠ型）常规使用法国SEPPIC公司206佐剂的基础上,设计了一种缓释作用更强的双佐剂成分疫苗。通过MTT法检测淋巴细胞增殖能力、液相阻断ELISA法检测口蹄疫抗体效价及攻毒试验测定PD50来评判该双佐剂疫苗与常规疫苗的效果差异。结果显示,双佐剂疫苗组细胞免疫水平（淋巴细胞刺激指数SI为1.235±0.060）比常规佐剂疫苗组（SI为1.115±0.035）和对照组（SI为1.010±0.045）高,与常规疫苗组相比差异显著（P＜0.05）,与空白对照组相比,差异极显著（P＜0.01）。双佐剂疫苗组O型和AsiaⅠ型抗体与常规佐剂疫苗组相比,全剂量组抗原量较充分,两组抗体水平差距不大;1/3剂量组和1/9剂量组由于抗原量较少和强缓释作用,导致抗体水平明显较低。攻毒保护结果为双佐剂疫苗组略高于常规佐剂疫苗组,前者每头份疫苗AsiaⅠ型为9.0 PD50,O型为11.84 PD50,后者每头份疫苗AsiaⅠ型为9.0 PD50,O型为9.0 PD50。由分析结果可见,双佐剂疫苗可引起较好的细胞免疫应答和缓释作用,达到好的攻毒保护效果。     

高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗中146S抗原含量的疫苗前处理方法比较

为提高高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量的准确性、适用性和操作性,分别采用正戊醇、正丁醇和三氯甲烷对9批口蹄疫灭活疫苗进行破乳处理,对三种方法的破乳后水相得率和146S抗原含量的色谱检测结果进行比较。结果表明,破乳后水相得率分别为:正戊醇38%~49%,正丁醇42%~44%,三氯甲烷50%;9批疫苗的色谱结果均检测到146S特征峰,146S含量在0.7~12.5μg/mL,3次测定的相对标准偏差最大值为4.0%,9批疫苗不同前处理方法的检测结果均值具有统计学意义,三氯甲烷组与正戊醇组数据一致性强,正丁醇组测定值偏低。使用三氯甲烷对疫苗进行破乳,不仅操作简便快速,而且破乳水相得率稳定,是最优的破乳方法。实验进一步优化了口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量检测的高效体积排阻色谱法,为该方法的科学应用提供了数据支撑。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗毒株不同宿主系传代中VP1基因的遗传变异研究

口蹄疫病毒结构蛋白VP1参与构成病毒粒子的主要中和抗原位点,是4种结构蛋白中最易发生变异的。在病毒传代过程中,对VP1基因进行遗传变异分析是口蹄疫疫苗研制中不可或缺的环节。为此,作者扩增了经不同宿主系（乳鼠、BHK₂₁细胞）连传不同代次的AsiaⅠ型毒株的VP1基因,并对其进行遗传变异分析,毒株间核苷酸同源性为99.4%~99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.6%~100%;制苗毒株经过不同宿主系有限传代后,与传代前的原毒(MF1)相比,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点较稳定,说明以此种方式获得的制苗毒株制备的灭活疫苗是稳定的,适用于该毒株流行区域内相关家畜的免疫预防。     

口蹄疫病毒P12X3C3D多基因编码蛋白在昆虫细胞中的表达与检测

利用杆状病毒表达系统构建了包含有口蹄疫病毒（FMDV）P12X3C3D多基因片段的重组杆状病毒。将该病毒感染Sf9细胞后，利用SDS—PAGE及夹心ELISA方法检测目的蛋白的表达。结果表明，重组杆状病毒能够表达FMDV目的蛋白，该表达产物能被FMDV阳性血清识别，具有一定的反应原性。     

不同厂家猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫效果监测

为准确掌握投放安徽省的A、B、C、D 4个厂家的猪O型口蹄疫灭活疫苗在实际生产中的免疫效果,2008年秋季至2011年春季,共采集了844个猪场10 439份免疫接种后1个月左右血清样,采用液相阻断ELISA检测了O型口蹄疫抗体滴度。结果显示,4个厂家疫苗的免疫接种效果差异明显,B厂疫苗免疫效果最好,D厂疫苗次之;不同年份疫苗的免疫接种效果差异显著,2010年的疫苗免疫接种效果最好。     

口蹄疫O、Asia1分型彩色胶乳试纸条诊断方法的建立

为建立一种快速、简便、直观的口蹄疫O、Asia 1分型彩色胶乳免疫层析的方法,作者选择2种不同颜色的单分散胶乳,将纯化的Asia 1/China/05流行毒株兔抗体制备蓝色免疫胶乳;将纯化的O/China/99流行毒株兔抗体制备红色免疫胶乳.将2种免疫胶乳分别喷涂于不同玻璃纤维上,晾干叠加制成彩色胶乳反应垫.再分别将纯化的Asia 1/YN/BSh/58/B和AV99(L)标准毒株的豚鼠抗体固定于同一硝酸纤维素膜的不同区域上作为2条检测带.最后组装成口蹄疫O、Asia 1分型彩色胶乳试纸条.通过对阳性参考样品的检测,结果显示试纸条有很好的灵敏度,可检测到病毒含量为3.90×104LD50;在检测与口蹄疫临床症状相似病原,如猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)抗原时无交叉反应,特异性好;不同批次间、同一批次内的试纸条,在检测阴、阳性参考样品时,结果完全一致,说明试纸条重复性好;试纸条对检测已知血清型的74份田间样品的符合性试验中,O型、Asia 1型样品的阳性符合率分别为95.24%、96.30%,阴性样品符合率为100%.本试验研发的口蹄疫O、Asia 1分型彩色胶乳试纸条具有很好的灵敏度、特异性、重复性和符合性,而且可以通过不同颜色进行定型检测,适合国内流行的口蹄疫病原型别的分型检测.     

基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

旨在研究口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）结构蛋白VP1上的RGD（Arg-Gly-Asp）基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术（SPR）的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β₆亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M^-1s^-1、3.1×10^-4s^-1和7.33×10^-6M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M^-1s^-1、2.13×10^-4s^-1和9.79×10^-5M;与β₆亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。     

口蹄疫病毒3B蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

为了深入研究口蹄疫病毒3B蛋白的结构及功能,本研究原核表达了3B蛋白并制备了针对3B蛋白的多克隆抗体。试验采用PCR方法扩增了口蹄疫病毒3B蛋白基因,并将其克隆到pET28a载体上,构建了重组质粒pET28a-3B,将其转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达。经过Ni-NTA琼脂糖亲和层析法初步纯化及Millipore超滤浓缩进一步纯化,将其免疫试验动物新西兰大白兔后制备出了抗3B蛋白的多克隆抗体。通过ELISA检测了该多抗的效价,Western blot试验检测了其反应性,通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验检测了该多抗的应用性。结果表明:该抗体的效价为1∶512 000,反应性良好;IFA试验和Western blot试验中可以检测到过表达后定位于细胞核和细胞质中的3B蛋白,也可以检测到在真核细胞中过表达的3B蛋白。说明本研究制备的口蹄疫病毒3B蛋白多克隆抗体可以作为开展该病毒相关研究的重要材料。     

猪O型FMDV主要抗原表位多肽的合成与鉴定

为筛选口蹄疫病毒表位抗原,使用Symphony 12通道多肽合成仪,采用Fmoc固相合成原理,合成5条O型FMDV抗原表位肽。Quattro Micro液-质联用仪分析多肽分子的结构特性,分析结果表明,在误差允许的范围内所检测的结果与理论值相符,5条多肽均通过质谱检测。通过SMCC双功能偶联剂将多肽偶联于BSA载体蛋白,以Dot-blot和间接ELISA法检测这5条与BSA偶联得多肽与O型FMDV阳性血清的结合能力,结果显示,中和表位Pep1、Pep2、Pep3能特异性结合O型FMDV感染血清和免疫血清,为抗FMDV中和表位单克隆抗体的制备和FMDV抗体检测试纸条方法的建立奠定基础。