口蹄疫病毒VP1基因C末端串连表达及其抗体ELISA方法的初步建立

口蹄疫病毒主要免疫原性基因VP1的B细胞和T细胞抗原表位位于其C末端,参照Taiwanse97(AJ294928)设计了1对特异性引物,扩增出VPl基因C末端。序列分析表明：其C末端长285bp,编码74个氨基酸,与O／HKN／12／91、O／PEN／TAW／99核苷酸和氨基酸同源性分别为95％、93％和96％、93％;利用同尾酶Xho I、Sall将VP1基因C末端串连起来;再将单拷贝和双拷贝C末端基因插入到原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得表达,经Western blot检测证实表达产物具有活性。以表达产物包被ELISA板,初步建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。同时用表达产物免疫Balb／c小鼠,能产生一定的抗O型口蹄疫病毒的抗体。     

口蹄疫病毒O/LZ株的分子特性分析

采用RT—PCR方法对口蹄疫病毒O／LZ株基因组序列进行了分子克隆和序列测定。结果表明：获得的0／LZ株除poly（C）和poly（A）外基因组序列长8104nt，其中包括1042nt的5’非编码区和6969nt的多聚蛋白编码区。将O／LZ株与其它参考毒株进行序列比较，结果显示O／LZ株与O／HNK／2002、O／ES／2001、O／CHP／TW／97等遗传关系最近，而与其它毒株遗传关系较远，属于O型口蹄疫Cathay拓扑型。与ME-SA拓扑型PanAsia株的毒株比较，两者在主要抗原位点1和位点3呈现出明显的以拓扑型为特征的氨基酸差别，提示两拓扑型毒株之间有较高的抗原差异。     

牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

为建立牛口蹄疫(FMD)抗体的检测方法,本研究将口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因,通过pPROEXTM HTb表达载体在大肠杆菌DH5α中表达,获得大小为35ku的重组VP2蛋白(rVP2),western blot证实rVP2可与FMDV5种血清型的牛阳性血清发生特异性反应。以纯化复性的rVP2为抗原建立了FMDVrVP2间接ELISA方法。重复性试验证实批内、批间变异系数均小于10%。特异性交叉试验表明,该抗原不与常见的其他7种牛病阳性血清发生交叉反应。检测非免疫无口蹄疫国家牛阴性血清的特异性为100%;检测感染血清敏感性为97.3%;检测O-AsiaⅠ的二价苗免疫牛血清,与4种商品化试剂盒比较,其符合率分别为69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。实验结果表明建立的ELISA方法可以用于口蹄疫感染和免疫抗体检测。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

表达FMDV 3AB抗原生产菌株稳定性试验

重组表达菌株的稳定性是决定试剂盒抗原生产的关键因素,对本室构建的重组菌株rNS- 3ABplysS携带质粒和表达蛋白的稳定性进行了研究,在含Amp的斜面连续传1～10代时,分别作了检测连续传代质粒、携带质粒DNA、抗原蛋白表达的稳定性试验。发现各菌株携带质粒稳定性较好,酶切及电泳图谱未有明显改变,且外源目标蛋白可稳定表达,可作为理想菌株。     

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the primary diagnosis of foot-and-mouth disease. Characterization and comparison with complement fixation

A sandwich type ELISA for foot-and-mouth disease (FMD) virus types O, A and C was established, using a combination of rabbit anti-146 S and guinea pig hyperimmune antibodies. This method was found to be highly efficient for the detection of both 146 S particles and 12 S subunits. The ELISA was approximately 500 times more sensitive than complement fixation (CF) when examining epithelial samples of FMD vesicles. An early primary diagnosis of FMD was obtained by both CF and ELISA in 19 out of 21 confirmed cases. The remaining 2 cases were initially negative in CF but positive in ELISA.     

Immune responses of recombinant adenovirus co-expressing VP1 of foot-and-mouth disease virus and porcine interferon alpha in mice and guinea pigs

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious and economically devastating vesicular disease of cloven-hoofed animals. In this study, we constructed and characterized the immune responses and vaccine efficacy conferred by the recombinant adenovirus co-expressing VP1 of FMDV and porcine interferon alpha as fusion protein (rAd-pIFNalpha-VP1). Six groups of female BALB/c mice each with 18 were inoculated subcutaneously twice 2-week intervals with the recombinant adenoviruses. The results showed that the levels of humoral and cell-mediated immune responses in the group inoculated with rAd-pIFNalpha-VP1 were significantly higher than those in the group inoculated with rAd-VP1+rAd-pIFNalpha (P<0.05). Then four groups of guinea pigs each with six were inoculated two times at 2-week intervals intramuscularly with rAd-pIFNalpha-VP1, commercial inactivated FMD vaccine, wild-type adenovirus (wtAd) or PBS, and the protective efficacy of rAd-pIFNalpha-VP1 was determined. The results indicated that all the guinea pigs vaccinated with rAd-pIFNalpha-VP1 as well as inactivated FMD vaccine were protected from FMDV challenge, even though the levels of neutralizing antibodies (1:32-1:40) of the animals vaccinated with rAd-pIFNalpha-VP1 was lower than that in the group inoculated with inactivated FMD vaccine (1:64-1:128). It demonstrated that the newly recombinant adenovirus rAd-pIFNalpha-VP1 might further be an attractive candidate vaccine for preventing FMDV infection in swine.     

口蹄疫疫苗非抗原蛋白对146S抗原免疫效果的影响

为探究非抗原蛋白对口蹄疫病毒A型(FMDV-A) 146S抗原免疫效果的影响,本研究以小鼠和猪为试验动物,分别制备5组小鼠注射用样品:A组(3μg 146S抗原)、B组(3μg 146S抗原+25μg非抗原蛋白)、C组(3μg 146S抗原+50μg非抗原蛋白)、D组(3μg 146S抗原+100μg非抗原蛋白)及E组(空白对照,PBS);同时制备4组猪注射用样品:A组(18μg 146S抗原)、B组(18μg 146S抗原+400μg非抗原蛋白)、C(18μg 146S抗原+4 000μg非抗原蛋白)及D组(空白对照,PBS)。免疫接种试验动物后,通过淋巴细胞增殖试验及实时荧光定量PCR评价比较不同疫苗样品组小鼠产生的细胞免疫应答水平,同时通过液相阻断ELISA方法检测、评价各试验组动物(小鼠和猪)产生的体液免疫应答水平。小鼠试验结果显示,在免疫后3个检测时间点内,4个试验组中C组的平均抗体水平最高,平均抗体效价分别为4.13、5.83和5.50,而D组的抗体水平最低,平均抗体效价分别为3.46、5.16和4.46;C组细胞增殖能力及Th-1型细胞因子IL-6、IFN-β和TNF-αmRNA表达量均高于其他组。猪试验结果显示,A组和B组间平均抗体水平差异不显著(P>0.05),但A组和B组的平均抗体效价均极显著高于C组(P<0.01)。综合上述结果表明,一定范围内少量非抗原蛋白对FMDV-A 146S抗原的免疫效果没有影响,而高浓度的非抗原蛋白则抑制FMDV-A 146S抗原的免疫效果。     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.     

口蹄疫病毒多抗原基因VP1-VP3-3C在大肠杆菌中的融合表达

应用PCR扩增技术获得1564bp的片段,包含口蹄疫病毒VP1全长基因、VP3部分基因和编码3C裂解酶全长基因,连接到pMD-18T载体上,在获得重组质粒pMD-18T-P13C后,进行序列分析;并成功地构建了重组表达质粒PGEX-KG-P13C,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE电泳。结果表明,P13C基因在大肠杆菌中获得成功表达,其表达产物为分子量83kDa的融合蛋白;能与猪抗FMDV血清发生反应,并为口蹄疫病的诊断及其基因工程疫苗的研究提供了依据。