猪卵泡形成中后期卵母细胞发育和闭锁变化的超微结构研究

本文采用了电镜观察猪卵泡形成中后期卵母细胞(OC)的超微结构,其结果有两种变化:一是进行性变化,其核在排出第一极体以前,都处于生发泡阶段。细胞质内含大量脂滴(Li),线粒体(Mi)和内质网(ER)囊泡集群分布于近皮质区;随OC 的增大,皮质颗粒(CGs)的直径、分布密度都增加,但膜距减少。微绒毛(MV)数量、直径和长度逐渐变少、变粗、变短,极少见到高尔基复合体(Go)。颗粒细胞(GC)逐渐老化。二是闭锁变化,其核膜皱折,染色质浓缩,Mi 互相融合并出现空泡。ER 囊扩大融合,Li 减少,核蛋白体和糖元颗粒不清,卵膜皱缩,与透明带间出现大的裂隙。GC 质中出现空泡,核膜破裂。GC 数量减少,严重的完全消失。统计分析表明,卵泡直径5mm 时其闭锁率最高。     

成年型牛淋巴肉瘤淋巴样细胞的核定量超微结构研究

本文通过细胞形态的定量分析技术研究了成年型牛淋巴肉瘤(LS)淋巴样细胞与正常淋巴细胞之间核仁及核膜超微结构的定量差别。结果表明:3组LS淋巴样细胞的单位细胞核体积中核仁所占体积较正常淋巴细胞平均分别增大70.73％、48.78％及80.49％,生统处理差异显著(P<0.05)或非常显著(P<0.01),3组LS淋巴样细胞的单位核体积所拥有的核膜表面积比正常淋巴细胞分别增大15.95％、18.76％和16.52,生统处理差异显著(p<0.05)或非常显著(p<0.01)。     

应用间接血凝试验检测牛肺疫抗体

自制1.5％绵羊红细胞诊断液并用于检测牛肺疫抗体,结果如下:(一)三批标准阳性血清(批号为8601、8301、8001)凝集价均在160倍以上,标准阴性血清(批号为8601)凝集度仅为10倍。15份被检血清IHA的阳性检出率(8/15)高于补体结合反应(CF,6/15)且凝集价均在40倍以上。(二)用牛肝片吸虫病、布氏杆菌病和附红细胞体病阳性血清作类症鉴别诊断,凝集度仅为10倍。(三)把牛肺疫CF8502抗原作倍比稀释,加2个凝集单位牛肺疫阳性血清8601和8301进行间接血凝抑制试验,分别被32倍和16倍稀释的抗原所抑制,本项试验结果表明IHA用于检测牛肺疫,具有检出率高、特异性强、设备要求简单、容易操作等特点,适于在现地推广应用。     

Research on Isolation and Clone of Embryonic Stem Cell-Like in Bovine

Bovine embryonic stem cell would be invaluable for researching the aspect of animal cloning, production transgenic animal and discussion of gene function in vitro. With the object of establishing an effective culture system for isolation and clone of bovine pluripotent stem cell, we cultured bovine embryos and mouse embryos including morula blastula and hatached blastula and obtained animal ICM on Primary marine embryonic fibroblast (Primary murine embryonic fibroblast, PMEF) feeder layer with tissue medium(DMEM supplemented with 15ml/100ml NBS ,0.1μmol/L Na2SeO3, 0. 1mmol/L β-mercaptoethanol, 1 000ng/ml LIF,10 ng/ml IGF, 1mmol/L necessary amino acid and 1mmol/L L-glutamine), then, we obtained mouse ICM and bovine ICM. Moreover, we isolated and cloned the 6 passage bovine ES like cells(12 cell lines) and 9 passage marine ES like cells (52 cell lines) deriving from bovine ICM and murine ICM respectively on the feeder layer of PMEF by disaggregating ICM and ES cell clones of bovine and murine into smaller clumps through digesting with 0. 125g/100ml trypsin and 0.02g/100ml EDTA and scattering with a glass needle. The pluripotency of both murine and bovine ES like cells was identified with morphological character, histochemistry identification, karyotype analysis and differentiation of ES cells in vitro or in vivo. This result showed that bovine embryonic stem cell and murine embryonic stem cell had developmental pluripotency.     

牛小腔前卵泡体外生长发育的研究

 在添加有ITS、丙酮酸钠、次黄嘌呤、血清、FSH、LH、E2的α-MEM基础液中加入表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维生长因子(bFGF)及氢化可的松（HC），对直径＜100 ?m（平均直径61～70?m）的牛小腔前卵泡进行体外培养。结果表明，试验I，在FSH、LH、E2浓度分别为0.25 ?g·ml-1、5 iu·ml-1、0.5 ?g·ml-1时，卵泡体外培养7 d， EGF和bFGF联合存在好于分别单独存在时的培养效果，当bFGF（25 ng或50 ng）剂量保持不变，提高EGF含量（25 ng,50 ng）有抑制卵泡发育的作用；增加bFGF的剂量有助于腔前卵泡的发育。 试验II，当FSH、LH、E2分别调整到4 ?g·ml-1、10 iu·ml-1、0.1 ?g·ml-1，并添加了氢化可的松（40 ng·ml-1），卵泡体外培养13 d，在试验3组（EGF 25ng）和试验4组（EGF 25 ng+ bFGF 50 ng），卵泡发育率和卵泡平均增长直径均显著好于试验1组（未添加EGF、bFGF、氢化可的松）和试验2组（只添加氢化可的松）。体外培养第20 d，试验3组和试验4组卵泡发育率分别为15.79 %和25.58 %，卵泡最大增长直径分别为300和320 ?m，并形成小的卵泡腔（成腔率分别为7.69 %和17.65 %），而试验1组和试验2组其卵泡发育率均为0。表明体外培养腔前卵泡时，不同的培养体系对其生长发育有十分重要的影响，各种成分之间存在互作的关系。     

支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立

以小鼠胎儿和牛睾丸为材料 ,以含 1 5 % NBS、0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇、0 .1 μmol/ L Na2 Se O3的DMEM溶液为培养液 ,分离获得了传 1 5代的小鼠胎儿成纤维细胞和 5代牛睾丸成纤维细胞 ,建立了小鼠和牛类 ES细胞培养体系。结果表明 :牛睾丸成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞均属附着生长型细胞 ,与小鼠胎儿成纤维细胞相比较 ,牛成纤维细胞直径和长度大 ,生长速度快 ,易于老化 ;1 2～ 1 6日龄的小鼠胎儿最适宜分离与克隆小鼠胎儿成纤维细胞 ;在 2 5℃条件下 ,以 0 .2 5 %胰蛋白酶 0 .0 4% EDTA消化液作用胎儿小块组织分离原代小鼠胎儿成纤维细胞 ,消化液作用时间不应超过 2 0 min,以相同的消化液在 3 7℃条件下 ,离散贴壁成纤维细胞 ,作用时间以 2～ 3 min为宜 ;培养细胞密度与传代时间间隔有密切关系 ,若传代时间间隔为 3～ 4d,培养细胞浓度应为 3× 1 0 5个 / ml～ 5× 1 0 5个 / ml;在成纤维细胞分离与克隆过程中 ,培养基中添加0 .1μmol/ L Na2 Se O3 0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 1 5 % NBS,有利于 MEF和 NBTF的增殖     

牛体内卵形巴贝斯虫裂殖体阶段的形态观察

 将“洁净”长角血蜱成虫饲喂在人工感染卵形巴贝斯虫的牛体上，俟饱血脱落并产卵孵化后，利用其次代幼虫、若虫和成虫、分别叮咬感染健康易感牛，对牛体内裂殖体阶段的卵形巴贝斯虫形态进行了观察。结果，在幼虫、若虫和成虫感染牛的末梢血液、心、肝、脾、肺、肾、淋巴结切面刮取物和体表淋巴结穿刺物涂片的淋巴细胞中，均观察到了裂殖体。所见裂殖体有两种类型；即由小梨子形裂殖子组成的小裂殖体和由大梨子形裂殖子组成的大裂殖体。     

Seven samurai to protect “our” food: the reform of the food safety regulatory system in Japan after the BSE crisis of 2001

Using the case of food safety governance reform in Japan between 2001 and 2003, this paper examines the relationship between science and trust. The paper explains how the discovery of the first BSE positive cow and consequent food safety scandals in 2001 politicized the role of science in protecting the safety of the food supply. The analysis of the Parliamentary debate focuses on the contestation among legislators and other participants over three dimensions of risk science, including “knowledge,” “objects,” and “beneficiaries.” The metaphor of “seven samurai” and the relationally situated roles of “samurai,” “bandits,” and “beneficiaries” are used to show that in the process of policy making certain moral and ethical expectations on a new expert institution for food safety were contested and negotiated to frame responsibilities and commitments of social actors for creating the food system based on trust.

不同转染方法转染牛体细胞效率的比较

为了从新转染方法与传统转染方法的比较中找出更为高效的转染方法,本研究以绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA为外源基因,分别采用核转染法、电穿孔法和脂质体法转染牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞).针对不同类型的细胞,实验首先对核转染法和电穿孔法的转染参数进行了系统的摸索和优化,然后将优化后的核转染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一致的情况下进行了转染对比实验,分析比较了转染48 h后的绿色荧光比率和细胞存活率.结果显示,核转染法转染胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞的优化程序分别是V013、T023和U023;在电穿孔法中,当电场强度为90 V/mm,脉冲时间为10 ms时,胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的转染效率最高,胎儿输卵管上皮细胞则在电场强度为80 V/mm,脉冲时间为5 ms时获得了最佳转染效率;最后通过转染对比实验得出,核转染法在3种细胞中都获得了最高的转染效率,分别为(98.78±0.30)％、(88.43±2.10)％和(71.31±0.77)％,均显著高于电穿孔法和脂质体法;转染后的存活率则为脂质体法最高,电穿孔法最低.研究结果说明,核转染法可以成为一种结合牛体细胞克隆技术生产转基因牛更有效的转染方法.     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的研究

卵母细胞生长发育和成熟调控机理的研究,是生殖生物学领域研究的热点和难点。研究发现,卵丘细胞的存在与否严重影响卵母细胞的体外成熟质量,且小鼠无卵丘的卵母细胞经体外成熟并常规体外受精后未能得到“试管后代”,表明常规体外培养方法明显降低无卵丘的卵母细胞发育潜能。可能的原因是:(1)卵母细胞与颗粒细胞间的间隙连接丢失,这种连接对卵母细胞的胞质成熟是至关重要的。(2)皮层颗粒的减少或继续生成路径的障碍。(3)卵母细胞易于贴底,造成变形,从而可能引起卵母细胞内细胞器机械性移位,造成损伤,且贴底后可能影响卵母细胞与培养基的物质交换。因此,探明卵丘细胞在卵母细胞体外成熟的作用及机制,探索培养无卵丘的水牛卵母细胞的新方法,对于今后进一步提高卵母细胞成熟质量具有重大的指导意义。本研究针对去卵丘细胞的卵母细胞体外培养存在的问题,以卵巢组织、卵丘细胞为介质来模拟卵母细胞在体内的状态,试验分为5组:M1,直接培养法(对照组);M2,与单层卵丘细胞共培养法;M3,未扩展卵丘细胞包围法;M4,扩展卵丘细胞团支撑法;M5,卵巢组织薄片包围法。培养24 h后计算第一极体(PB1)排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活。结果发现:成熟24 h时,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其他各组间没有显著差异(P>0.05);孤雌激活结果显示M5组的卵裂率显著低于M1组(P<0.05),而M2组与M1组间没有差异(P>0.05);但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组(P<0.05)。结论:(1)扩展卵丘细胞团支撑法支持无卵丘的水牛卵母细胞的体外核质成熟,而未扩展卵丘细胞包围法促进卵母细胞胞质的成熟,这可能是通过重新构建卵丘-卵母细胞间的间隙连接实现的;(2)与单层卵丘细胞共培养法并不能促进无卵丘的水牛卵母细胞的核成熟及其发育潜力;(3)用卵巢组织包围不能模拟体内卵巢的环境,且卵巢组织可能分泌抑制卵母细胞胞质成熟的因子。目前对无卵丘卵母细胞的培养方法的研究甚少,而我们建立的卵丘细胞团包围/支撑法及卵巢组织包围培养法未见类似的报道。本研究初步建立了水牛无卵丘卵母细胞的有效培养方法,将为研究卵母细胞生长发育和成熟调控机理提供新的模型,为利用无卵丘的水牛卵母细胞提供理论和技术支持。