枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺研究

［目的］优化枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺。［方法］采用系列预处理、初步层析和精细纯化试验。［结果］优化的分离纯化工艺为：发酵液经离心、三氯乙酸处理、超滤浓缩脱盐,再上阴离子交换柱,或用乙醇处理后贮存,为离子交换备用。初步层析介质用阴离子交换QSepharoseF.F.,缓冲体系为TrisHCl（pH值8.0）,体系电导率为6.0mS/cm,上样量为240.0ATU/ml介质,产品纯度为70.2％,回收率达90.0％。用SephacrylSi100凝胶过滤柱精细纯化水蛭素,在一定流速范围内,流速对纯化效果影响不大,上样量可为10.0ml,得到的纯品纯度可达95.1％,得率为93.0％,SDSPAGE电泳为单一条带。［结论］可为进一步工业化分离纯化水蛭素研究提供借鉴。     

甘薯黑痣病防治药剂的筛选

为了筛选对甘薯黑痣病防效良好的药剂,首先采用滤纸片法在室内测定了1种生防菌剂和21种化学杀菌剂对甘薯黑痣病菌的抑菌作用,结果表明,咯菌腈、咪鲜胺、多菌灵和枯草芽孢杆菌表现出较好的抑菌效果,在50 mg／L质量浓度下抑菌圈直径分别为4.75 cm、1.55 cm、1.20 cm和3.60 cm。用以上4种杀菌剂分别处理带病种薯、秧苗、土壤,进行甘薯黑痣病的田间防治试验,结果显示,枯草芽孢杆菌的效果不及3种化学药剂,咪鲜胺的效果最佳,其处理带病种薯的病苗防效为88.1％,处理秧苗、土壤的病指防效达到83.8％和97.4％。     

一株水产地衣芽孢杆菌的鉴定及培养基优化

从水产养殖环境中分离、筛选得到一株菌CJ001,经菌落形态特征、生理生化特征及16S rDNA测序,鉴定其为地衣芽孢杆菌.地衣芽孢杆菌可有效降低养殖水体中的化学需氧量(COD),48 h内COD的降解率达86.8%,水温30℃时的降解率最高,达到85.7%.为优化培养基组成,选出由单因素试验确定的营养物质(红糖、玉米粉...     

枯草芽孢杆菌DNKAS对加工番茄分枝列当的防治应用

分枝列当（Orobanche aegyptiaca）是一种根寄生植物,严重影响加工番茄的产量。为减轻其危害,首先通过皿内芽管生长试验,明确了枯草芽孢杆菌DNKAS对分枝列当芽管生长有显著抑制作用;并通过田间小区随水滴灌方式,设置清水对照（CK）、3 kg·hm^-2 DNKAS菌剂（D3）、4.5 kg·hm^-2 DNKAS菌剂（D4.5）、6 kg·hm^-2 DNKAS菌剂（D6）、9 kg·hm^-2 DNKAS菌剂（D9）、12 kg·hm^-2 DNKAS菌剂（D12）、7.5 kg·hm^-2黄腐酸钾（FA-K）、4.5 kg·hm^-2 DNKAS菌剂+7.5 kg·hm^-2黄腐酸钾(D4.5+FA-K) 共8个处理,研究不同处理对分枝列当的防治效果和增产效果;随后采用 Biolog-ECO微平板检测法,分析菌剂施用后土壤微生物群落的生态及代谢多样性变化,明确菌剂对作物及环境的影响。结果表明,纯菌剂施用条件下,D12处理的防治效果最佳,防效为52.33%,列当寄生数量最低为493个,寄生度为1.30,番茄产量为133 455 kg·hm^-2,增产56.48%。黄腐酸钾与菌剂混合施用效果明显优异于其单独施用,防治效果提高了14%,寄生度和寄生数降低约10%,番茄产量提高14%。不同处理的微生物代谢活性表现为：D4.5+FA-K > FA-K > D12> D9,不同处理间的碳源利用率差异不明显,Shannon多样性指数差异显著,表明生防菌DNKAS可增加土壤群落丰富度,生防菌KNKAS及其与黄腐酸复配可提高防效,适用于分枝列当防治。     

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)是纳豆发酵产氨的关键酶.本文以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板,根据枯草芽孢杆菌的GDH编码基因(RocG)序列设计引物,进行PCR扩增,再经pMD19-T质粒TA克隆,获得了全长为1275 bp、与RocG基因同源性为98%的纳豆芽孢杆菌GDH的编码基因.构建原核表达载体pET28a-GDH,转化至E.coli BL21(DE3)进行体外诱导表达.表达的包涵体在超声破菌、变性、纯化和复性后,经SDS-PAGE分析得到了47 kDa的特异条带.纳豆芽孢杆菌GDH同时具有NAD+和NADP+依赖活性,酶活分别为6.7723 U·mg-1蛋白和9.4205 U·mg-1蛋白.     

乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌联合培养研究

本文对乳酸杆菌(HnL-3)和枯草芽孢杆菌(HnB-4)进行了单独培养和联合培养。结果表明,将HnL-3与HnB-4优化后的培养基进行联合培养24 h后得到的菌浓度为4.8×109个/mL,与单独培养时菌液浓度差异不显著。因此,可将2种菌联合培养用于改善动物肠道微环境。     

颉颃细菌GXG-2-2的菌株鉴定及其对植物病原菌的颉颃作用

从枯草中分离筛选获得的颉颃细菌GXG-2-2被鉴定为枯草芽孢杆菌。该菌有很强的分泌胞外蛋白酶的能力。于发酵液中加入60%饱和度的（NH4）2SO4沉淀所得的蛋白粗液对多种植物病原菌有强烈的抑制作用。例如稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、烟草赤星病菌（Alter-naria alternata）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）等。     

PCR-RFLP筛选DNA文库克隆Bt cry基因的研究

 Bt菌株C0 0 2对水稻二化螟、甜菜夜蛾具有高毒力 ,PCR RFLP鉴定含有cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知杀虫蛋白基因cryX等 ,其中cry1Ca位于染色体DNA 6～ 9kb的EcoRI片段。染色体和质粒DNA分别经EcoRI完全酶切和Sau3AI部分酶切、电泳回收 6～ 9kb片段。E .coli Bt穿梭载体pHT315分别与目的DNA连接、转化大肠杆菌感受态细胞后获得了相应的DNA文库。约 5 0个转化子合为一个转化子池 ,采用PCR RFLP方法快速检测 ,分别从约 2 0 0 0质粒DNA文库转化子和 4 0 0个染色体文库转化子中筛选获得了cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知基因cryX的阳性克隆 ,相应命名为pHT 1Aa、pHT 1Ca、pHT 2Ab和pHT X。限制酶切分析表明 ,含有cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab基因的克隆片段均含有相应基因的保守物理图谱。进一步将这些质粒分别导入Bt无晶体突变株CryB-,SDS PAGE分析表明 ,只有cry1Ca表达了约 130ku杀虫晶体蛋白。初步杀虫生测结果显示 ,cry1Ca对甜菜夜蛾具有高毒力 ,7d校正死亡率为 10 0 %。     

苏云金杆菌液体剂型的研制

用凯松ＣＧ和尼泊金甲酯作复合防腐剂,吐温－２０作湿润展着剂,木质素磺酸钠和山梨醇作紫外光防护剂,人工甜味剂作昆虫食欲促进剂,油酸作杀虫增效剂,研制出了高效、稳定的苏云金杆菌液体剂型。在一年的正常存放试验中,液剂效价保持率８９％。加速降解试验表明,４５℃条件存放２５ｄ,液剂效价保持率为７３％。在紫外光照射下,当新研制的剂型效价保持率为９０．２％时,对照保持率仅为３６．６％。     

一株防治黄瓜霜霉病的地衣芽孢杆菌 HS10 的防病机理初探

【目的】地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）HS10 是前期筛选到的一株对黄瓜霜霉病具有较好防效的生防菌株,拟观察该菌株的防病谱,探究其防病机理。【方法】通过比较与黄瓜霜霉病菌具有相似分类地位的病原菌,选择荔枝霜疫霉菌引发的霜疫病作为防控对象,预处理采后和田间荔枝果实,观察对霜疫病的防效;通过分析该菌株产生的粗蛋白和植物抗病相关酶活性初探其防病机理。【结果】HS10 菌株对采后荔枝果实霜疫病防效为 62.36％,田间防效为 46.00%;终浓度为 50 μg/mL 粗蛋白对田间日光温室黄瓜霜霉病生防效果为 60.08%;胞外粗蛋白可抑制辣椒疫霉菌丝生长,造成菌丝顶端生长异常,膨大扭曲、畸形;经 HS10 菌株处理黄瓜植株,PAL 和 POD 活性呈现“上升 - 下降 - 上升”的趋势。【结论】地衣芽孢杆菌 HS10 对其他同类病害也具有防效,通过胞外分泌蛋白抑制菌丝生长,以及通过诱导植物防御酶活性改变达到防病抑菌的作用,为后续深入探究防病机理奠定基础。