pCAMBIA2300-betA-BADH双价基因植物表达载体的构建

摘要：本实验以载体pCAMBIA2300-35s-OCS为基础通过分子克隆手段,将甜菜碱合成途径的两个关键酶基因,即编码胆碱脱氢酶（CDH）的betA基因和编码甜菜碱醛脱氧酶（BADH）的BADH基因及启动子和终止序列构建在同一植物表达载体上,得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体。并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404,进一步用于双子叶植物的遗传转化。     

农杆菌介导的梭梭BADH基因转化玉米的研究

探究影响玉米遗传转化效率的因素,对玉米遗传转化系统的建立与完善有重要意义。以‘宁玉0905’为材料,经农杆菌介导将梭梭的BADH基因转入玉米基因组。结果表明：在黑暗条件下,加入乙酰丁香酮(AS),玉米遗传转化效率提高;当菌液浓度OD₆₀₀=0.3,浸染时间为5 min时,玉米的转化效率最高;农杆菌和愈伤组织共培养2天,玉米的遗传转化效果最好。对转化苗进行PCR检测得出BADH基因已整合到玉米基因组中。当菌液的OD₆₀₀=0.3,浸染时间为5 min,农杆菌和愈伤组织共培养2天时,玉米的转化效率最高。     

朝鲜碱茅BADH基因3′端及5′端部分序列的扩增

为探索朝鲜碱茅的耐盐,耐寒和耐旱的抗性机理,从已知禾本科植物朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的一段保守区序列,以此序列为研究基础,结合其他禾本科植物的BADH基因保守区序列设计引物,扩增出朝鲜碱茅BADH基因3′端序列及5′端部分序列共1 502 bp。经BLAST比对,结果表明,获得到的朝鲜碱茅BADH基因序列与羊草和大麦的BADH基因的同源性达到89%,含有保守的十肽序列和其后29位与酶功能有关的Cys。     

甘菊BADH基因启动子的克隆与瞬时表达分析

为了给菊花 [Dendronthema ×grandiflora (Ramat.) Kitam.] 的转基因育种提供诱导型启动子,借鉴5′RACE策略,利用锚定PCR步移的方法克隆了甘菊 [Dendranthema lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino] 甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因的4个启动子序列,分别命名为DBP11、DBP12、DBP21和DBP22（GenBank登录号：DQ497620~DQ497623）,序列长度分别为1 230、1 249 、1 273 和574 bp。4个启动子序列对应区域的同源性在89%以上。其中DBP12和DBP21分別是甘菊BADH基因DlBADH1和DlBADH2（GenBank登录号：DQ011151和DQ011152）的启动子序列,DBP11和DBP22为甘菊BADH基因家族中其它成员的启动子序列。序列分析表明,上述启动子序列中均含有多处与水分胁迫和脱落酸诱导相关的顺式作用元件。在表达载体pCAMBIA1305.2的基础上,用所克隆的4个甘菊BADH基因启动子序列分别置换驱动其报告基因表达的35S启动子,建立了新的植物表达载体。用其转化农杆菌,并用叶盘法侵染甘菊,瞬时表达的结果表明,这些启动子序列均具备驱动报告基因表达的功能。     

四倍体刺槐转甜菜碱醛脱氢酶基因的研究

试验以所建立的四倍体刺槐高频再生体系为基础,通过农杆菌介导法转化甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因,以GUS染色组织分析法为依据探讨了影响转化效率的各种因素,建立了优化转化体系,结果如下:20mg·L~(-1)乙酞丁香酮可显著提高转化效率;菌液浓度OD_(600)值0.3～0.7、预培养2d为宜;转化后暗培养对转化效率没有影响。并在以上研究基础上,成功地建立了高效、可重复的遗传转化体系,选择培养基上头孢霉素400mg·L~(-1)可有效地抑制农杆菌;卡那霉素50mg·L~(-1)时愈伤组织的白化死亡率达96.4％。经PCR检测,外源基因已成功的整合到植株的基因组DNA中,获得了15个转基因株系。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因油菜的获得及其耐盐性研究

以9个甘蓝型油菜(Brassica nupas L.)材料为受体,分别以其子叶和下胚轴为外植体,利用农杆菌将来自山菠菜的BADH基因导入甘蓝型油菜,研究了转化植株的抗盐性.结果表明,依据对农杆菌侵染的反应,参试品种可划分为三种类型:抗性类型(resistant type,R);超敏感类型(supper susceptive type,SS)和中间类型(middle type,M).R型外植体切口易发生过敏反应导致失去再生能力;SS型外植体极易受农杆菌快速增殖影响,最终导致整体褐化死亡;只有M型外植体还保留部分再生能力,可产生少量不定芽.通过改进培养方式可提高外植体在农杆菌胁迫下的芽发生频率,在无菌滤纸上进行共培养,不仅能降低"玻璃化"现象,还能延长共培养时间,为外植体细胞的再分化提供了时间保障.分化培养基中加入3～6 mg/L AgNO3可减轻外植体褐化程度,提高不定芽分化率.PCR分析和BADH活性检测发现,有部分转化体BADH酶活性明显高于对照,表明转基因植株在盐胁迫下外源BADH基因已表达,转基因植株能够在0.5%NaCl培养基上正常生长,而对照在相同的培养基上生长缓慢且生根困难.     

转BADH基因水稻旱作与水作条件下籽粒干物质积累动态的比较研究

对转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因水稻品系52-7旱作与水作条件下的籽粒灌浆期干物质积累动态进行了比较研究。结果表明:旱作与水作条件下,强势粒和弱势粒的籽粒增重和淀粉积累过程均符合Richards模型。水作强、弱势粒的异步灌浆比旱作明显;旱作强、弱势粒的平均灌浆速率比水作大,到达最大灌浆速率的时间提前,活跃灌浆期缩短;旱作强势粒的最大灌浆速率比水作增大,旱作弱势粒的最大灌浆速率比水作小。开花后5～20d,旱作强、弱势粒的淀粉积累量都略高于水作,之后,则低于水作。水、旱作强势粒可溶性糖含量的变化趋势基本一致,但其弱势粒间的变化趋势存在明显差异。旱作与水作的千粒重差异达到显著水平,但穗粒数、实粒数、结实率及产量的差异未达到显著水平。     

转BADH基因稻田节肢动物群落结构研究

以转BADH基因抗逆稻不同株系为试材,亲本中花8号为对照,研究了转BADH基因稻田节肢动物群落结构变化。结果表明:转基因不同株系稻田与对照田相比,节肢动物群落组成基本相似,但物种发生量不同。不同处理稻田中优势种类变化不大。转基因株系与对照稻田节肢动物群落在结构组成上的差异主要是由害虫亚群落引起的,而各转基因株系不论在害虫亚群落还是在天敌亚群落上差异均相对较小。稻田节肢动物群落的多样性、均匀度与优势集中性指数等群落特征指标综合分析表明,不同稻田节肢动物群落各项稳定性指数虽然稍有差异,但都表现为相对稳定。     

盐胁迫对转SacB、BADH基因的美丽胡枝子部分逆境生理指标的影响

为了探讨盐胁迫下外源基因对植物渗透调节的影响,以同时培育的转入果聚糖蔗糖转移酶（SacB）基因、转甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因及未转基因的美丽胡枝子盆栽苗为材料,研究不同浓度(0、0.5%、1.0%、2.0%)NaCl处理对3种试验材料的耐盐性及盐胁迫下的脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖、丙二醛含量、过氧化物歧化酶活性的影响。结果表明:在未进行盐胁迫时,3种试材的这几项指标含量没有明显差异,但随着盐胁迫强度的增加,两种转基因的美丽胡枝子在积累脯氨酸、可溶性糖能力方面明显强于非转基因植株,转入BADH基因的美丽胡枝子在积累甜菜碱上要强于非转基因植株及转入SacB基因的植株;尽管在盐胁迫强度增大的情况下,3种植株的过氧化物歧化酶活性增强了,但两种转基因植株的过氧化物歧化酶活性并没有明显大于非转基因植株;两种转基因植株可明显抑制丙二醛在植物体内的快速积累。      

向日葵甜菜碱醛脱氢酶的电子克隆与分析

采用电子克隆技术获得了向日葵甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA序列(HaBADH)。该序列长1901bp,编码一个由503个氨基酸残基组成的蛋白质。HaBADH与其他物种的BADHs在蛋白质水平上表现较高的相似性,在进化上与同科的甘菊BADH蛋白距离较近。HaBADH蛋白具有醛脱氢酶家族高度保守的十肽和与酶功能有关的氨基酸残基Cys。