昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定

 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin (Drs)及其同系物Drosomycin-like C (Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达，对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因（Drs）及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组，构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA–Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子，在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用，Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母，并实现其分泌型表达。     

拟南芥中一个与ABA信号途径相关未知蛋白质的研究初报

利用酵母双杂交系统在拟南芥cDNA文库中筛选出1个与ABI2有相互作用的未知蛋白质（AC）。在酵母系统中的进一步研究表明，AC与ABI1、ABI2有相互作用，其作用依赖于ABI1、ABI2的PP2C活性。在大肠杆菌中表达和纯化了与预测结果一致的AC蛋白质。构建了真核过量表达载体，转化拟南芥后筛选和鉴定出转基因AC植株。转基因植株的生理性状分析表明，AC基因的过量表达降低了植物对ABA敏感性。研究初步证明AC可能是脱落酸信号传导途径中的1个新信号分子。     

蜡梅花cDNA文库构建及其高频出现脂转移蛋白cDNA的表达

【目的】构建蜡梅花cDNA文库，分析蜡梅脂转移蛋白基因的表达，为探索蜡梅冬季开花分子机理，分离克隆特色基因奠定基础。【方法】以蜡梅花器官为材料，用SMART cDNA Library Construction Kit 构建文库，RT-PCR分析基因表达。【结果】经测定原始文库滴度达到1.4×106 pfu/ml，扩增总文库滴度约为1010pfu/ml，重组率达到96%，插入片段在0.5 kb 以上，平均约1.1 kb，通过PCR 检测，从总文库中检测到了表达丰度不同的蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段，说明所构建的文库覆盖度高、代表性强，LTP基因具有内含子，而总文库中扩增出的LTP基因不含内含子，说明所构建的cDNA文库无基因组DNA污染， LTP基因在蜡梅开花各个时期均表现较高的转录水平，与EST分析时高频率出现LTP序列的情况相符，证实所构建的文库能够反映蜡梅开花过程基因表达的基本情况。【结论】已获得高质量的蜡梅花cDNA文库，可以用于进一步的基因克隆或EST测序分析，这是首次正式报道蜡梅cDNA文库的构建。LTP基因在蜡梅开花过程中可能具有重要的生物学功能，为探索蜡梅冬季开花分子机理提供了线索。     

鲤脑组织cDNA文库的构建及鉴定

用Gubler—Hoffman法构建了耐低温鲤Cyprinuscarpio脑组织全长cDNA文库,经测定库容量为5．7×10^5cfu／mL,文库的重组率接近95％,平均插入片段长度为1500bp,符合文库保存和筛选实验的要求。同时,根据鲤与低温相关的消减eDNA文库中低温下特异表达基因的片段序列,设计了PCR引物,并在此eDNA文库中进行PCR检测和序列测定。使用BLAST软件将测序的10个cDNA序列同GenBank等数据库进行比对,结果显示,8个阳性克隆有相关同源性,2个克隆为功能未知的基因,全长率接近75％。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸（Met）的活性形式。生物体内,SAM由S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）[EC2．5．1．6]催化L．甲硫氨酸（L．Met）和A11）反应而合成。酿酒酵母细胞中有2种SAM合成酶的同工酶,即SAMS1和SAMS2,分别由基因saml和sam2编码,二者氨基酸序列的同源性高达92％。在过量L-Met存在下,saml的转录受到抑制;已有酶促法合成研究显示sam2编码的合成酶没有产物抑制现象。笔者将sam2基因连接于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,并通过同源重组整合到酵母染色体上,以实现SAM合成酶的分泌性表达,为开发和建立酶促法生产SAM工艺奠定基础。     

沙门氏菌诱导后家蝇幼虫cDNA文库的构建

采用沙门氏菌以针刺法诱导家蝇三日龄幼虫,提取诱导后培养24 h的家蝇幼虫总RNA,进一步分离、纯化其mRNA,运用SMART技术构建家蝇幼虫cDNA文库.结果表明:原始文库的滴度为1.55 × 106 pfu/mL,原始文库重组宰为99.5%,文库扩增后滴度达1.27 × 10 pfu/mL.从扩增文库随机挑取10个噬菌斑克隆进行PCR扩增鉴定,结果显示所选的lO个噬菌体克隆均合有重组的cDNA,插入片段大小为400～1 500 bp.     

巨型艾美球虫株间差异表达基因消减文库的构建和分析

为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础.     

cDNA文库构建策略及其在盐生植物中的应用

构建各种cDNA文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法.cDNA文库主要包括cDNA全长文库、cDNA差减文库和cDNA均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同.近年来,通过构建各种cDNA文库、获得大规模高质量EST数据库,并在此基础上分离克隆抗逆相关基因已经成为研究植物耐盐机理的重要途径.旨在对cDNA文库的主要类型及其构建策略,以及cDNA文库在盐生植物新基因筛选中的应用进行综合论述,并对植物耐盐机制的研究提出了展望.     

犬α1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。     

酵母培养物对肉仔鸡屠宰性能及胴体品质的影响

主要研究在玉米豆粕基础日粮中添加酵母培养物(YC)对肉仔鸡屠宰性能及胴体品质的影响。将960只1日龄肉仔鸡随机等分为4组,其中试验3组,对照1组,试验组分别添加2.5 g/kg,5 g/kg,7.5 g/kg的YC,试验期为1~42 d。结果表明:①试验各组肉仔鸡的胸肌率、腹脂率、半净膛率和全净膛率与对照组相比差异不显著(P>0.05),但添加2.5 g/kg、7.5 g/kg YC的试验组可显著提高肉仔鸡的腿肌率(P<0.05);②在肉鸡日粮中添加YC显著降低了胸肌、腿肌的剪切力(P<0.05);滴水率有下降趋势(P>0.05);pH值(45 min)亦有降低。研究证明:在日粮中添加一定量的YC能降低肉仔鸡胴体肌肉的剪切力及滴水损失,提高肉的嫩度及持水能力,达到改善肉鸡的屠宰性能和肌肉品质的目的。