里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

经改造的猪IGF-I基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

采用酵母偏爱密码子合成五条编码猪IGF-I基因的引物，利用重叠PCR技术拼接获得长度为210bp的猪IGF-I成熟蛋白基因。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中，转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌，以1.5%甲醇诱导培养后，经SDS-PAGE检测表达产物，在7.5 kDa处出现一特异蛋白条带，目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明，重组蛋白可与抗IGF-I多克隆抗体反应。     

臭氧结合拮抗酵母对草莓采后灰霉病的控制

为了寻找一种能够代替化学杀菌剂控制草莓采后病害的方法,试验研究了臭氧与罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii (Ku?erath) Skinner）结合使用对草莓采后灰霉病的控制效果的影响。研究表明,臭氧处理能显著降低草莓采后灰霉病发病率、抑制草莓水果伤口处致病菌数目和抑制霉菌孢子的萌发。经过2 d的贮藏,臭氧处理与罗伦隐球酵母结合使用草莓灰霉病的发病率为29.63%,显著低于对照处理（70.37%）,同时也低于臭氧处理及罗伦隐球酵母单独处理的发病率（分别为48.15%和44.44%）。在20℃和4℃下培养,罗伦隐球酵母在水果伤口处能迅速地增长,并持续保持较高水平。臭氧处理与罗伦隐球酵母结合处理能诱导草莓果实的多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）和b-1,3-葡聚糖酶（GLU）活性的提高,同时可以抑制脂氧合酶（LOX）活性的增加。     

葡萄酒酵母选育研究进展

文章综述了葡萄酒酵母的分离筛选、驯化、鉴定方法以及育种手段等方面的研究进展,为优良葡萄酒酵母的选育提供借鉴。     

添加酵母核酸对肉鸡肉质的影响

320羽Avian雏鸡按饲养试验要求分为4组(每组4个重复,每个重复20羽),设对照组(饲喂玉米豆粕型基础日粮),试验组在基础日粮中分别添加酵母核酸0.05%、0.1%和0.2%,42日龄时,进行屠宰试验, 每组16羽(每个重复4羽), 共64羽, 采集胸肌肌肉样品,测定有关肉质的指标.结果表明,酵母核酸显著提高了胸肌粗蛋白含量3.21%～3.80%(P<0.05),粗脂肪含量则呈下降趋势(P>0.05),干物质、灰分各组之间无明显影响;添加酵母核酸显著提高肌肉肌苷酸和腺苷酸含量,分别为22.16%～35.03%(P<0.05)、41.44%～55.86%(P<0.05), 次黄嘌呤含量各组之间无明显的影响;具有提高肌红蛋白含量的趋势(P>0.05);添加酵母核酸显著提高了胸肌中甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量和必需氨基酸总量、氨基酸总量,其中,试验组1甘氨酸提高了44.97%(P<0.05),试验组2亮氨酸提高了17.67%(P<0.05),试验组3酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、必需氨基酸总量、氨基酸总量分别提高了37.34%(P<0.05)、29.24%(P<0.05)、17.39% (P<0.05)、14.44%(P<0.05)、10.94%(P<0.05).添加酵母核酸对肉鸡胸肌中常量和微量元素含量无明显的影响.     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒cDNA文库的构建及部分序列分析

急性病毒性坏死症病毒（Acute Virus Necrobiotic Virus,AVNV）已被证实是一种对养殖栉孔扇贝（Chlamys farreri）危害极大的致病病原.本研究应用基因克隆技术对AVNV基因组进行cDNA合成、克隆,并对部分克隆进行序列分析.采用差速和蔗糖密度梯度离心法,分离纯化AVNV.用Trizol试剂抽提病毒RNA,采用随机引物和Oligo（dT）双引物法,SuperScriptⅡ反转录酶合成cDNA,并克隆于pUC118质粒上,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,PCR法快速鉴定重组质粒.经筛选得到2个阳性克隆23^#、52^#,插入片段大小约为1200 bp和800 bp.测序结果与GenBank的比对分析显示,尚未有类似的序列报道,提示该病毒可能为一种新发现的病毒.[中国水产科学,2006,13（3）：421-425]     

酵母菌C10产菊粉酶酶学性质的研究

采用菊粉酶活力测定的方法研究了酵母菌C10所产菊粉酶的酶学性质。该酶的最适温度和最适pH分别为50℃,5.5。在此条件下,该酶酶活力达到12.0U/mL,I/S值为14.0,其水解菊粉后低聚糖得率为29%。1.5%菊芋干粉为合成菊粉酶较好的诱导物;Mn2 ,Ca2 ,Mg2 对菊粉酶有激活作用,Zn2 ,Cu2 ,Fe2 有抑制作用。该菊粉酶中胞外酶,胞壁酶,胞内酶分布为7.5∶0.5∶2.0。研究了底物浓度对酶反应的影响,当底物浓度达到20mg/mL时,产物浓度基本不变,反应初速度达到最大值。     

利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。     

生防菌季也蒙毕赤氏酵母增殖培养基优化研究

从培养基出发,研究了生防菌季也蒙毕赤氏酵母的增殖培养条件。通过测定菌体数量,绘制了季也蒙毕赤氏酵母的生长曲线;确定PDB培养基为季也蒙毕赤氏酵母优化出发培养基;最适增殖培养时间为20h。对碳源、氮源、无机盐、维生素进行单因素试验筛选出较好的组分,然后通过正交试验对培养基条件进行了优化,获得较优的增殖培养基组成为:果糖2%、酵母膏0.8%、MnSO40.1%、烟酰胺0.001%。季也蒙毕赤氏酵母优化培养基的菌体增殖数量可达基础培养基PDB的19.6倍。