基于转录组数据分析环形泰勒虫对诱导宿主细胞转化相关基因的影响

本试验主要通过研究布帕伐醌(BW720)处理前后,环形泰勒虫转化牛单核细胞(TaNM Ⅰ)转录组数据的变化情况,为进一步研究环形泰勒虫诱导宿主细胞转化的分子机制奠定基础。以环形泰勒虫感染的牛单核细胞为试验材料,设置对照组(二甲基亚砜,DMSO)和试验组(BW720),利用Illumina HiSeq4000测序平台进行高通量测序,将测序得到的原始数据(Raw reads)与GenBank和Rfam数据库进行比对过滤,通过质控获得最终数据(Clean read)。利用Venn分析软件筛选出DMSO组和BW720组中差异表达明显的基因,进行功能注释(GO)以及信号通路(KEGG)分析。随机选择10个基因,利用荧光定量PCR (qPCR)检测基因在不同处理条件下细胞中的表达量。在验证测序结果的准确性后,选出差异表达明显的基因,分析其在TaNM Ⅰ细胞的凋亡、增殖等信号通路方面的作用。结果显示：BW720组和DMSO组中分别得到6 854 019 704和6 627 265 854条Raw reads,过滤、质控后分别得到22 925 606和22 171 427条Clean reads。BW720组和DMSO组中筛选出差异表达明显的基因共计4 054个(P＜0.05),其中,2 146个基因显著上调,1 908个基因显著下调;进一步筛选出共同差异表达的基因367个,其中,显著上调的196个,显著下调的171个。同时,qPCR验证随机选择10个基因的表达趋势与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠。然后对差异表达基因进行GO功能注释,筛选到与细胞增殖相关的20个生物学过程、15个细胞组分以及11个分子功能条目。KEGG富集分析结果显示,在Top20的信号通路中筛选出与环形泰勒虫转化细胞有关的一些信号通路,如：癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等。对这些信号通路进一步分析发现：PI3KR3、FOXO1、IL23A、FZD3、AKT、MMP9等基因在环形泰勒虫转化细胞的研究中也有相关文献的报道。本研究表明,在TaNM Ⅰ细胞中DAPK1、FZD3、FOXO3、PI3KR3等可能在感染细胞无限增殖的过程中发挥作用,为后续研究TaNM Ⅰ细胞无限增殖机制奠定了基础。     

产蛋前期和产蛋高峰期鸡全基因组甲基化差异及其对肝脏转录组影响的研究

旨在通过对产蛋前期和产蛋高峰期鸡肝全基因组甲基化差异进行分析,解析基因组甲基化对不同发育阶段肝中基因表达差异的影响。本研究采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术对产蛋前期（20周龄）和产蛋高峰期（30周龄,各3只DNA混池）卢氏绿壳蛋鸡肝全基因组的甲基化水平进行检测,并与已有的肝mRNA转录组数据进行整合分析,探讨基因组甲基化对不同生理阶段基因表达差异的影响。结果表明,全基因组范围约有4%的胞嘧啶（C）发生了甲基化（mC）;两个生理阶段的总体甲基化水平基本一致。共检测到670个差异甲基化区域（DMRs）和356个差异甲基化基因（DMGs）。基因本体（GO）和相关信号通路（KEGG）分析发现,超甲基化DMGs显著富集在发育的正向调控、细胞形态改变的调控、VEGF信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控、粘着斑及间隙连接等相关过程,低甲基化DMGs显著富集在胚胎消化道形态的发生、间充质细胞增殖的正向调控、淀粉和蔗糖代谢及Wnt信号通路等相关过程。基因不同功能区域甲基化水平与基因表达水平有关,启动子（promoter）及基因体（gene body）区域甲基化水平与基因表达水平呈显著负相关,其他区域（内含子、3'UTR）的甲基化水平与基因的表达水平无明显关系。其中,与肝脂质代谢相关的候选基因RASD1、HAO1、UBE2O、MSRB3受甲基化调控。本研究绘制了不同生理时期卢氏绿壳蛋鸡全基因组甲基化图谱,结合mRNA转录组数据阐述了DNA甲基化在基因表达方面的调控作用,并鉴定出了不同生理时期受甲基化调控的基因,为深入研究表观遗传调控在不同生理时期蛋鸡肝代谢中的作用机制提供参考。     

双组分调控系统介导革兰阴性菌耐药的作用机制

菌群耐药已成为临床上亟待解决的关键问题,特别是革兰阴性菌引起的耐药现象尤为突出,给临床治疗带来了巨大的挑战,尽快阐明重要细菌复杂耐药表型的调控机制就显得尤为重要。双组分调控系统(two-component regulatory systems,TCS)存在于多种革兰阴性菌中,在细菌诸多生命活动中发挥关键作用,是细菌感知环境变化并产生相应调控的主要机制之一。TCS通常由两种蛋白组成,包括感受器蛋白(通常是组氨酸激酶)和反应调节蛋白(通常是转录因子),二者可通过磷酸化介导的协同作用,整合细菌周围的环境信号、调节细菌相关的基因表达及改变细菌的某些生理行为。近年来,探索细菌TCS介导的耐药性应答机制已成为一个新的研究热点。基于此,本文从TCS介导临床重要革兰阴性菌耐药的结构基础和作用机理等方面进行综述,以期增进对细菌TCS的全面认识,为今后临床上药物的科学研发提供新的思路和对策。     

系统分析多组织转录组鉴定影响猪脂肪沉积的关键基因

旨在挖掘影响松辽黑猪脂肪沉积的关键基因及脂肪、肝和肌肉在体内的功能。本研究选择体重100 kg左右健康且背膘厚差异显著的6头(高、低各3头)松辽黑猪为试验动物,利用高通量转录组测序技术检测其脂肪、肝和背最长肌组织中基因的表达水平,鉴定不同脂肪沉积猪和不同组织中的差异表达基因,并分析差异表达基因的生物学功能。结果表明,在不同分组的猪中发现135个差异表达基因,其中部分参与了PPAR信号通路、AMPK信号通路、代谢通路、脂肪酸代谢和甘油代谢等通路。经生物学功能分析发现,EHHADH、ME1、SCD、OLR1、PHGDH、ACLY、LEP和CYP超家族基因等基因为影响猪脂肪沉积的关键基因。在不同组织的差异表达表达基因中,脂肪组织中高表达的基因显著富集在胰岛素信号通路、MAPK信号通路、三羧酸循环、氧化磷酸化等通路;肝中高表达基因显著富集在多种物质的代谢、脂肪酸的降解、氨基酸的合成等通路;背最长肌中高表达的基因主要参与了蛋白质的降解、PI3K-Akt信号通路、氧化磷酸化通路、Wnt信号通路、磷脂酰肌醇信号通路等通路。不同组间差异表达基因分析结果提示,EHHADH、ME1、SCD、OLR1、PHGDH、ACLY、LEP和CYP超家族基因等基因是影响脂肪沉积的关键基因;不同组织间差异表达基因表明,脂肪组织是脂肪合成的主要部位,而肝和肌肉组织主要涉及脂肪酸的降解。本研究结果对脂肪性状的遗传改良、机理解析有一定意义。     

利用加权基因共表达网络分析筛选天农麻鸡胴体性状候选基因

旨在通过转录组测序(RNA-Seq)与加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)筛选慢速型黄羽肉鸡天农麻鸡胴体性状相关候选基因。本研究以104只天农麻鸡为素材,在126日龄时进行屠宰,测定胸肌重等7个胴体性状,采集胸肌组织进行RNA-Seq。基于RNA-Seq数据获得基因表达矩阵后,结合表型进行WGCNA分析,确定目标模块,筛选目标模块的枢纽基因,并分别进行KEGG通路富集、蛋白质互作网络(protein-protein interaction network,PPI)构建和相关性分析。104份胸肌组织RNA-Seq质控后获得15 092个基因的表达量。与胴体表型进行WGCNA,共得到19个模块,其中4个模块与胴体性状极显著相关。功能富集结果表明,目标模块内基因主要富集在ECM-受体相互作用、黏着力等通路。以|Module membership|> 0.8、|Gene significance|> 0.2为标准筛选到58个枢纽基因,并通过PPI网络构建鉴定到5个网络节点基因,整合相关性分析确定COL1A2和SPARC为最重要候选基因。本研究通过大样本量转录组分析,发现ECM-受体相互作用等通路在天农麻鸡胴体性状调控中发挥主要作用,筛选到COL1A2和SPARC是影响全净膛率性状的重要候选基因,研究结果为鉴定选育分子标记,解析胴体性状分子机制奠定理论基础,为慢速型黄羽肉鸡育种提供重要参考。     

基于转录组测序的高羊茅分蘖与株高相关差异表达基因分析

分蘖与株高是禾本科草类植物重要的农艺性状,明确参与调控分蘖与株高的基因类型对牧草和草坪草分子辅助育种具有重要意义。以表型差异明显的两个高羊茅品种“Kentucky-31”（K31）和“Regenerate”为材料,旨在构建高羊茅分蘖节转录组图谱,挖掘在分蘖节部位调控生长发育相关的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。基于高通量测序技术平台Illumina HiSeq 2500×Miseq 300进行转录组测序,并将得到的数据进行de novo组装,结果共获得77872条单基因簇（unigene）。将获得的unigenes与非冗余蛋白数据库（non-redundant protein database,NR）、蛋白质数据库（universal protein,Uniprot）、基因本体数据库（gene ontology,GO）、东京基因与基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）以及直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups,COG）数据库进行比对,结果显示：分别有59927、40213、44447、15146和13767条unigenes成功获得注释。“Regenerate”与“K31”对比有1573个上调DEGs和1441个下调DEGs。GO富集分析发现,DEGs主要富集在细胞、细胞组分、大分子复合物组装等生物过程。DEGs中共注释到42个差异表达转录因子,主要包括TCP、WRKY和ARF等19种类型。还注释到与8类植物激素相关的DEGs,包括生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、乙烯、油菜素甾醇、水杨酸和茉莉酸。利用实时荧光定量PCR对DEGs进行表达模式验证,发现其与RNA-Seq测序结果一致,证实了测序结果的准确性。研究结果丰富了高羊茅的转录组序列资源,初步获得控制株高及分蘖发育的候选因子,为进一步开展基因功能及分子育种研究提供了理论支持。     

基于RNA-seq筛选白藜芦醇致猪卵巢颗粒细胞凋亡的可变剪接基因

本研究旨在探究参与白藜芦醇（Resveratrol,RES）诱导猪卵巢颗粒细胞（Porcine Ovarian Granulosa Cells,pGCs）凋亡的可变剪接基因。实验以50、100μmol/LRES处理pGCs,并设置空白对照,利用转录组测序（RNA-seq）技术分析3组之间差异可变剪接基因的表达谱,对差异可变剪接基因进行GO和KEGG富集分析,通过qRT-PCR验证RNA-seq数据。结果表明,与对照组相比,低浓度组有198种基因参与了236个可变剪接事件,高浓度组有603种基因发生了779个可变剪接事件。在log2|FoldChange|>1、P<0.05条件下,分别在低浓度组筛选到6个、高浓度组筛选到35个差异可变剪接基因。GO分析显示,差异可变剪接基因主要参与生物学过程条目。KEGG分析发现,显著富集的通路均与激素分泌及代谢途径相关,如卵巢类固醇生成信号通路、氨基酸代谢相关信号通路等。进一步从中筛选出可能参与RES诱导pGCs凋亡的关键基因（AKR1C1、GLUL、SARDH、MADD基因）。综上,RES通过影响pGCs中基因的可变剪接,从而影响相关信号...     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

野生盘羊×巴什拜羊杂交二代尾部脂肪差异表达lncRNA的鉴定与分析

【目的】 分析不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探究lncRNA与绵羊尾部脂肪沉积机制的关系,为揭示绵羊尾脂沉积机制提供理论依据。【方法】 选择新疆地方绵羊巴什拜羊(肥尾型)和野生盘羊×巴什拜羊杂交二代(小尾型)作为研究对象,采集2个群体尾部脂肪组织,利用转录组测序技术筛选差异表达lncRNA并预测靶基因,对其进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用实时荧光定量PCR技术验证转录组测序的表达结果。【结果】 通过差异表达分析共筛选出728个差异表达lncRNAs,其中270个表达下调,458个表达上调;通过差异表达lncRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析,筛选到634个靶基因参与疾病、免疫、蛋白修饰、细胞代谢等相关功能分类,共涉及76条信号通路,部分lncRNA介导的靶基因SCD、GPAM、THRSP、FASN等与绵羊尾部脂肪沉积相关。实时荧光定量PCR与转录组测序结果趋势相同。【结论】 lncRNA在绵羊脂尾进化中对尾部脂肪沉积具有重要的调控作用,为从lncRNA的角度分析绵羊脂肪沉积提供了理论依据。     

伊犁鹅产蛋前后各期卵巢转录谱的构建及卵泡发育相关基因的分析

【目的】构建产蛋前后各期伊犁鹅卵巢转录组文库,结合生物信息学分析揭示不同产蛋期伊犁鹅卵巢组织差异表达基因,并鉴定出影响鹅卵巢发育的关键基因,为伊犁鹅的繁殖调控提供理论参考。【方法】选择处于开产期（KL组）、产蛋期（CL组）及休产期（XL组）的伊犁鹅各4只,屠宰后取其卵巢组织,用于构建卵巢转录组文库。通过新基因挖掘、基因差异表达、基因注释以及蛋白互作网络分析筛选出与鹅卵泡发育相关的候选基因;随机挑选8个差异表达基因,应用实时荧光定量PCR验证其表达情况。【结果】伊犁鹅卵巢组织学结果表明,在开产期时,伊犁鹅卵巢表面有大量初级卵泡,而产蛋期卵巢则显示出卵泡的层级性,在休产期卵巢中可观察到卵泡出现向内凹陷、闭锁的现象。通过转录组测序（RNA-Seq）,从构建的12个伊犁鹅卵巢cDNA文库中获得有效读数57 811 186~85 328 377条,Q30值均>93.38%,每个样品所产的测序读数于鹅参考基因组上的比对率在82.79%~89.24%。在卵巢中注释的新基因共有1 112个,单核苷酸多态性（SNP）位点总数为1 642 273~2 425 069个;SNP和插入缺失（InDel）均主要注释于内含子区域;各时期的可变剪切类型主要集中为最后1个外显子可变剪切（TSS）及第1个外显子可变剪切（TTS）。在KL vs CL、XL vs CL及XL vs KL组中分别有337、1 136和525个差异表达基因,共有差异表达基因为α2A肾上腺素能受体（ADRA2A）、表皮蛋白（CP）、非转移性黑色素瘤糖蛋白B （GPNMB）及α-1-抗胰蛋白酶样（LOC106033756）。GO功能富集分析发现,差异表达基因主要富集在肽基酪氨酸磷酸化的正调控、细胞黏附及质膜外侧等过程。KEGG通路富集分析发现,差异表达基因主要显著富集于神经活性配体-受体相互作用、ECM-受体相互作用及类固醇生物合成等。结合蛋白互作网络分析,筛选到与鹅卵巢发育相关的潜在调控因子Bruton’s酪氨酸激酶（BTK）、血小板源性生长因子受体α（PDGFRA）、整合素β3（ITGB3）等。实时荧光定量PCR结果显示,RNA-Seq结果准确可靠。【结论】本研究揭示了产蛋前后各期伊犁鹅卵巢组织中的基因表达差异,筛选到影响伊犁鹅卵巢发育的神经活性配体-受体相互作用、ECM-受体相互作用、类固醇生物合成等重要通路与BTK、PDGFRA和ITGB3等关键候选基因,为了解鹅卵巢组织调控产蛋性能的分子机制提供了理论支撑。