用于山羊痘病毒载体的强痘病毒启动子筛选

为提高重组山羊痘病毒(GPV)中外源基因的表达水平及筛选强转录效力的启动子,本研究选择桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子(42K)、痘病毒合成晚期441启动子(SL441)、痘病毒合成晚期454启动子(SL454)、牛痘病毒(VV)早晚期P7.5启动子(P7.5)、VV晚期P11启动子(P11)、VV H6启动子(H6)、VV合成早晚期启动子(E/L)及人工优化早晚期启动子(LEO)8种启动子,并在其下游插入萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因,分别构建了启动子效力检测重组质粒。并分别将其转染于预感染GPV的DF-1(鸡)、LT(绵羊)、BHK-21(仓鼠)和Vero(猴)4种动物源细胞中,以表达海肾荧光素酶(Rluc)的p RL-TK为内参质粒,24 h后检测荧光素酶活性。结果表明,在LT细胞中,SL441转录效力最强;在DF-1细胞中,LEO转录效力最强,为其他启动子的1.19~14.46倍;在Vero细胞中,H6和SL441的转录效力较强,达到其他启动子的1.21~11.24倍;在BHK-21中,H6启动子的转录效力也显著强于其它启动子。本实验最终确定了GPV在4种动物源细胞中转录效力强的启动子,该研究结果为进一步提高以GPV为载体疫苗的免疫效力奠定了基础。     

粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的克隆及其功能分析

【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】克隆得到粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列1 863bp,其中含TATA框、CAAT框等启动子核心序列及GATA、STAT、C/EBP等转录调控元件。双荧光素酶报告基因检测系统分析表明,相对于空载体pGL3-Basic,所构建的重组载体p(-1 673/+25)具有明显的启动子活性。【结论】克隆得到的启动子片段明显具有启动报告基因表达的能力,可用于在胰蛋白酶基因启动子水平和转录因子水平研究杠柳新苷活性化合物的激活机理。     

基于荧光素酶活体成像筛选转基因玉米植株的条件优化

通过比较活体成像系统中不同玉米芽长、曝光时间及合并像素值的荧光素酶信号强弱,优化利用活体成像系统筛选转荧光素酶玉米植株的条件。结果表明,在玉米芽长3～8 cm、喷施底物反应2 min后曝光时间5 min、像素合并值binning 8×8的条件下,能够较好地检测到植株荧光素酶信号;进一步对获得的转基因玉米植株进行活体检测,确定了信噪比值大于2.0的植株为强表达阳性植株。研究结果可为转基因植株的后代筛选提供新方法,可以淘汰大量非转基因和表达较弱的植株或株系,有效提高筛选效率。     

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。     

35S标记物放射自显影方法的改良

放射自显影是一种在感光片上将同位素分子加以显迹和定量的技术。常用的同位素有３５Ｓ和３２Ｐ，两者发射的都属于β－粒子。由于３５Ｓ发射β－粒子的能量较低，只有０．１６７ＭｅＶ，致使其很难穿透０．２５ｍｍ的Ｘ－乳胶光片［１］。因此，用３５Ｓ标记物作放射自显...     

PDPK13′UTR双荧光素酶报告载体的构建及与gga-miR-148a-5p的靶向验证

本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因载体中;将gga-miR-148a-5p及阴性对照分别与野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。Targetscan、miRbase数据库预测结果显示,gga-miR-148a-5p与PDPK1基因3′UTR存在互补结合位点;酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性试验结果表明,gga-miR-148a-5p mimics能够与PDPK1基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性。gga-miR-148a-5p能够与PDPK1靶向性结合,PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。     

LDLR激动剂模型的建立及上调LDLR功能的黑茶品类筛选

建立低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor,LDLR)激动剂药物筛选模型,并用该模型筛选出具有上调LDLR功能的黑茶品类。合成LDLR启动子片端(189bp),克隆入含有萤火虫荧光素梅报告基因的p GL3-basic载体中,构建了重组报告基因质粒p GL3-LDLR,以p RL-TK为内参质粒,瞬时转染人肝癌细胞Hep G2;以降脂药物辛伐他汀作为阳性对照物,优化反应条件,再应用该模型对8种黑茶水提取物进行了初步筛选。结果表明,辛伐他汀对荧光素酶的表达具有较强的诱导作用,且呈一定剂量的依赖性,Z′因子为0.72,表明该模型具有很好的灵敏性和稳定性,成功地建立了靶向LDLR转录活性的双报告基因筛选体系,并发现待测黑茶均有一定的激动活性,其中金花天成茶对模型的激活值最高,激活值达1.761。