拟态弧菌外膜蛋白OmpU 基因的原核表达及其免疫保护性研究

自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEx-4T-1-OmpU.将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21进行IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9 kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性.用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×103CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15).表明OmpU是拟态.弧菌的保护性抗原之一,具有研发成为外膜蛋白基因工程亚单位苗的潜在价值.     

奶牛抗热应激中草药添加剂对小鼠热耐力的影响

试验研究奶牛抗热应激中草药添加剂对热应激小鼠机体耐力的影响。试验分A、B、C、D4个处理,每个处理20只小鼠,分别喂以不同添加剂浓度的饲料21d[A组:0.5g/(10g体重)、B组:0.25g/(10g体重)、C组:0.13g/(10g体重)、D组0g/(10g体重)],每日光暗节律各12h,自由摄食与饮水。试验结果表明,A、B组体重增加显著高于C、D组(P<0.01),A、B、C组小鼠死亡数显著少于D组(P<0.05),受热90min后,A、B、C组小鼠肛温比D组分别低0.3℃、0.3℃、0.5℃(P<0.05),说明该添加剂具有一定的提高小鼠热耐力作用。     

睡眠干扰对雄性KM小鼠生殖健康的影响

研究通过间隙性闹铃方式对雄性KM小鼠进行睡眠干扰,探讨其对生殖健康的影响。试验选取雄性KM小鼠(20日龄,n=40),随机分为试验组和对照组,其中试验组小鼠施以间隔20min闹铃干扰1次、持续时间1min,对照组则不做任何处理。80日龄后,通过测定比较脏器系数、附睾精子活率、精子密度、畸形率,以及低渗肿胀实验,评定分析生殖生育力情况。结果显示:睡眠干扰对肾脏、睾丸脏器系数的影响不明显(P>0.05),但致附睾脏器系数明显下降(P<0.05);睡眠干扰还造成精子畸形率显著增高(P<0.05)、精子质膜完整率极显著下降(P<0.01),但对精子数量和活率影响不明显(P>0.05)。     

茶多酚对雄性小鼠F-2毒素中毒抑制作用的研究

本试验为了探讨茶多酚对F-2毒素致雄性生殖系统损伤拮抗作用,在试验中取20日龄50只随机分成(Ⅰ)对照组,(Ⅱ)毒素组,(Ⅲ)茶多酚低剂量组,(Ⅳ)茶多酚中剂量组,(Ⅴ)茶多酚高剂量组,每组10只。第十一天解剖取睾丸进行实验,测定SOD活性MDA含量等指标,切片观察。结果表明:实验测量组与对照组的SOD活性及MDA含量差异极显著。茶多酚对雄性小鼠F-2毒素中毒有抑制作用,且茶多酚中剂量组(100mg/ml)及低剂量(50mg/ml)的防护与抑制作用最佳。     

鹿茸对昆明小鼠精子质量的影响

目的本试验旨在探究鹿茸对昆明小鼠精子质量的影响。方法雄性昆明小鼠48只随机分为空白对照组以及3mg/kg低剂量组、6mg/kg中剂量组和12mg/kg高剂量组,连续经口灌胃鹿茸14d。结果灌胃给雄性昆明小鼠6mg/kg鹿茸和12mg/kg鹿茸时精子活动率、精子数量和精子成活率显著高于对照组;高、中、低三个剂量组对精子畸形率均无显著影响。结论灌胃给药6mg/kg和12mg/kg鹿茸时,可提高雄性昆明小鼠的精子质量。     

鹿茸对雌性小鼠生殖功能的影响

目的本试验旨在探究鹿茸对雌性小鼠生殖功能的影响。方法雌性昆明小鼠48只随机分为空白对照组以及3mg/kg低剂量组、6mg/kg中剂量组和12mg/kg高剂量组,连续经口灌胃鹿茸14d。结果高剂量组小鼠的雌二醇水平、性器官脏器指数显著高于空白对照组;中剂量组和高剂量组小鼠的子宫外径显著高于空白对照组。结论灌胃给药12mg/kg鹿茸时,可使雌二醇含量增高,促进雌性器官生长发育,增强雌性昆明小鼠生殖功能。     

小鼠催乳素释放肽的初步克隆

为克隆并分析小鼠催乳素释放肽基因,从小鼠下丘脑提取总RNA,进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T连接后转化E.coli DH5α,检测阳性克隆并测序。测序结果表明,所得序列与大鼠催乳素释放肽编码区序列的相似指数为86.3%。克隆所得序列为小鼠催乳素释放肽的基因片段。     

两种激活处理促进小鼠孤雌胚胎原核形成

不同人工处理方法激活哺乳动物卵母细胞的机理相似,但其激活效率存在差异。本研究以昆明（KM）、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1雌鼠来源的卵母细胞为对象,利用氯化锶（SrCl2,Sr2＋）联合细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）（Sr2＋＋CB）和离子霉素（ionomycin,Ion）联合6-二甲胺基嘌呤（6-dimethylaminopurine,6-DMAP）（Ion＋6-DMAP）两种激活方法处理下对比分析不同品系小鼠卵母细胞的激活效率,并以卵母细胞原核形成率、原核数量和孤雌胚胎体外发育来评价两种激活剂的激活效率。研究结果表明,Ion＋6-DMAP激活卵的1原核比率显著高于2原核（p〈0.05）,Sr2＋＋CB激活卵的2原核比率显著高于1原核（p〈0.05）;KM、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1各组孤雌胚胎卵裂率和激活率没有显著差异（P〉0.05）,但129/Sv×KM F1和C3H×KM F1囊胚发育率显著高于KM组（p〈0.05）。3种小鼠品系的卵母细胞用Sr2＋＋CB处理的孤雌胚胎发育率显著高于Ion＋6-DMAP。结果证明,Sr2＋＋CB处理小鼠卵母细胞的激活效率明显优于Ion＋6-DMAP;129/Sv×KM F1和C3H×KM F1的孤雌胚胎体外发育率显著高于KM小鼠,为研究小鼠遗传背景影响孤雌胚胎发育的机理提供参考。     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L) 放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。     

中药有效成分对小鼠2-细胞胚胎体外发育的作用

如何获得更多具有活力的可操作的桑椹胚、囊胚一直是胚胎体外培养的研究热点。近二十年来,虽经采用改进培养液成分、改善培养条件、建立体细胞与胚胎共培养体系和添加生长因子、细胞因子等手段,胚胎质量有所提高,但体外受精卵的囊胚发育率仍远低于体内受精,与体内受精囊胚相比,体外受精囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数量明显减少,胚胎移植妊娠率和产仔率较低,这些问题均严重影响了胚胎工厂化生产和胚胎产业化的发展,以及育种工作的进程。因此,探索开辟胚胎体外培养生长发育的新途径,提高其发育率和移植妊娠率显得尤为必要。目前,国内外有关中草药有效成分对体外胚胎发育作用的研究甚少。本研究以ICR小鼠2-细胞胚胎为试验材料,将中药有效成分黄芩苷(Baicalin,Bai)、川芎嗪(Ligustrazine,Lig)和小檗碱(Berberine,BR)添加于mCZB基础液中,并以添加双抗的mCZB基础液为试验对照组,比较其对胚胎体外发育的影响。结果表明,体外培养120 h的胚胎孵化率,Bai组(80.6%)、Lig组(78.3%)及BR组(75.9%)极显著高于对照组(51.8%)(P<0.01)。孵化胚胎细胞计数,BR组、Lig组和Bai组(分别为87.2±8.6、83.9±7.7和81.9±6.2),与对照组(77.4±5.6)差异极显著(P<0.01)。说明3种中药有效成分均能显著促进小鼠早期胚胎的体外发育及胚胎细胞增殖。为进一步探讨Bai、Lig、BR对胚胎体外培养发育的效果和验证其胚胎质量,将不同组别培养至桑椹、囊胚期的胚胎进行两种程序常规冷冻,解冻后继续培养,观察其冷冻效果,并将各组解冻后发育至囊胚期胚胎移植。结果表明:冷冻解冻桑椹胚体外培养8~14 h囊胚发育率,程序一中Bai组(65.8%)和Lig组(81.1%)分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)地高于对照组(48.6%)和BR组(46.7%);程序二中Bai组(80.6%)、Lig组(78.3%)极显著高于对照组(55.2%)和BR组(47.6%)(P<0.01)。冷冻解冻囊胚体外培养6~8 h囊胚发育率,程序一中各组间无显著差异(P>0.05);程序二中,中药有效成分各组间差异不显著(P>0.05),但均显著高于对照组(P<0.05)。两种冷冻程序效果差异不显著(P>0.05)。移植妊娠率和产仔率,Bai组(56.3%,63.3%)、Lig组(52.6%,67.3%)和BR组(55.0%,60.5%)均高于对照组(46.2%,52.8%)。说明3种中药有效成分对于提高小鼠2-细胞胚胎体外发育质量具有一定促进作用,并有利于提高冷冻解冻后移植胚胎的发育潜力。