嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93．1％-95％之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot,在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学,2008,15（2）：301—306]     

中国大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)PCR检测方法的建立及其应用

大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国工厂化养殖大菱鲆的主要病毒性病原之一.本研究提取了该病毒DNA,依据其主要衣壳蛋白基因序列设计了PCR引物,优化了PCR反应参数,建立了TRBIV的PCR检测方法,测试了该方法的特异性和灵敏度,并应用该方法开展了TRBIV的流行情况调查及研究了大菱鲆的外观症状(红体)与TRBIV感染的关系.结果显示,本研究建立的TRBIV PCR检测方法可以从相当于100ng病鱼组织中或103数量级的病毒粒子中检出TRBIV,也可以在不杀死被测鱼的情况下,仅从鱼体中抽取少量血液即可在1天的时间内完成大量样品的TRBIV检测,但不能从健康大菱鲆脾组织和患淋巴囊肿牙鲆的囊肿组织中扩增出任何产物,说明该方法具有很高的灵敏性和特异性;在所调查的山东半岛5家大菱鲆养殖场的19尾大菱鲆中,7尾为TRBIV阳性或弱阳性;具有"红体"症状的大菱鲆应当划分为"病毒性红体病"、"细菌性红体病"和"非病原性红体症"3种不同的类型.本研究为TRBIV的流行情况和传播途径调查、疾病的快速诊断和控制提供了技术手段;调查结果显示TRBIV已遍布山东半岛沿海地区的大菱鲆主产区,在地域上相距较远的多个大菱鲆养殖场流行,今后需要密切关注该病毒的传播和流行.     

西洋杜鹃栽培月事活动

1至2月 气候特点：8．5℃～10．4℃,1月平均8．5℃。2月平均10．4℃;1月中旬至下旬会出现霜冻,有时还会结冰。栽培技术：①定时喷施KH2PO4促花,直至初花时结束;②棚温低于8℃的阴冷天气时。应在大棚里加一小拱棚;降温太低时,采用电热器(尤其在夜间22时至凌晨3时)加热,或定距离置放生石灰;     

柿树栽培的综合管理

柿树喜温、耐干旱,多生长在我国北方黄淮流域。柿树寿命长。在产区,百年以上大树比比皆是,柿树丰产性好,几百年大树,只要肥水跟上,一样年年丰产。它既是水果也是木本粮食。柿子营养丰富,含糖量高,含维生素是苹果的十几倍。有养胃健脾润肺抗病等功能。可鲜食,还可加工杮块、杮饼、罐头、饮料;杮叶可制杮叶茶,有抗癌,消食,顺气之功能;杮盖可入药,有消食顺气之良效,杮树不是上等木材。近几年部分地区     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

杂草环境下转EPSPS基因大豆NZL06-698的生态适应性研究

为研究转EPSPS基因大豆NZL06-698在杂草环境中的生态适应性,试验设置杂草处理模拟野外环境,研究转基因大豆NZL06-698(GT698)的生存竞争能力以及外源EPSPS蛋白表达情况。结果表明:在相同处理下转基因大豆GT698的株高(R8期)、百粒重显著高于亲本大豆蒙豆12(MD12),但单株产量、单株籽粒数、结实率显著低于亲本大豆,说明外源基因的存在并未增强转基因大豆的生存竞争力,且转基因大豆在野外的生存竞争能力与亲本大豆相比较弱。试验注意到,杂草环境对转EPSPS基因大豆的生长有明显的限制作用,杂草处理下转基因大豆的单株产量、单株籽粒数、百粒重、结实率等指标均显著低于对照处理。ELISA检测结果表明,转基因大豆叶片及籽粒中外源EPSPS蛋白在杂草处理及对照中均正常表达,且两种处理下的EPSPS蛋白表达量无显著差异。以上结果表明杂草环境中转基因大豆的EPSPS蛋白正常表达,正常提供抗草甘膦性状,但是外源基因的存在并没有增加转基因大豆的生存竞争能力,且转基因大豆的生长受到杂草环境的显著抑制,由此得出结论:与亲本大豆相比,转EPSPS基因大豆NZL06-698在野外环境中生态适应能力较弱。     

东北三省大豆种质品质性状鉴评与综合分析

根据目标性状有的放矢的选配杂交亲本是提高优异品质组成品种的选择效率的基本前提。本研究对东北三省102份大豆种质资源的蛋白、氨基酸组分、油份及脂肪酸组分进行测定,通过遗传多样性、主成分和聚类分析,对其进行表型鉴定及基因型分类以综合评价种质品质特性。结果表明:东北三省大豆种质油份及脂肪酸组分变异较丰富,遗传多样性程度较高。根据主成分分析筛选到9个主成分进行聚类分析,通过聚类分析将供试种质资源分为5类。第I类群蛋白含量较高、油份含量偏低,第II类群蛋白、油份含量均居中,第III类群油份含量较高、蛋白含量偏低,第IV类群高油,第V类群高蛋白,类群间的氨基酸、脂肪酸组分各有差异。需根据育种目标在群体间选配亲本,以提高品质育种的效率。     

大豆小肽螯合铁的制备工艺及光谱分析研究

通过铁源筛选比较得知,氯化亚铁比较适合与大豆小肽进行螯合反应制备大豆小肽螯合铁,利用响应面法优化了大豆小肽螯合铁的制备工艺,优化结果为:小肽与亚铁盐质量比4∶1,反应pH5.0,反应温度40℃,得到离子螯合率平均值为56.81%,经中试车间生产试制得到大豆小肽螯合铁的得率是78.3%,螯合率为82.39%,检测大豆小肽螯合铁的主要成分中的蛋白含量为78.94%,铁的含量为10.87%。红外和紫外光谱分析检测结果显示:大豆小肽和大豆小肽螯合铁(Fe~(2+))红外吸收峰的强度在不同波长位置上有明显的变化,大豆小肽螯合铁(Fe~(2+))在紫外波长上发生了明显的位移且宽化,表明大豆小肽螯合铁(Fe~(2+))形成了络合物。同时对大豆小肽螯合铁的结构进行了预测。     

水稻着丝粒特异组蛋白CENH3抗体的制备与应用

【目的】着丝粒是真核生物染色体的基本功能元件之一,其功能是在细胞有丝分裂和减数分裂时期精确地调控染色体配对和分离并维持染色体的稳定。着丝粒结构是由DNA和蛋白质形成的一种复合体。着丝粒特异组蛋白(centromere-specific histone H3,CENH3)是功能着丝粒是否具有活性的最基本特征。所以制备CENH3的相关抗体是进行着丝粒结构与功能研究的前提条件之一。【方法】通过设计短肽进行兔免疫实验,制备了水稻着丝粒特异组蛋白CENH3兔源抗体,利用ELISA和蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)等检测方法对抗体有效性进行了鉴定。【结果】ELISA检测显示制备的CENH3抗体有效稀释度为1:40万,并且蛋白免疫荧光信号在水稻体细胞每条染色体的着丝粒区域均能检测到。同时,该抗体也可以应用于玉米等其他物种。通过染色质免疫沉淀(ChIP)技术获得与CENH3相结合的DNA分子,并进行PCR扩增和FISH定位分析,结果显示相应的Ch IP-DNA位于水稻功能着丝粒区域。【结论】本研究制备的水稻CENH3兔源抗体能满足着丝粒研究中相关实验的要求,可进一步应用于着丝粒的结构与功能研究。     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。