稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO-K1细胞系的建立及免疫原性分析

建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到高表达Cap蛋白的悬浮稳转单克隆细胞株,并对该细胞株进行发酵,纯化得到的目的蛋白,通过小鼠免疫验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达;发酵过程中活细胞密度高达6×10~6个·mL^-1,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg·L^-1;利用间接ELISA检测小鼠免疫后血清中的抗体水平,证明了利用CHO-K1细胞生产的Cap蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并进一步对目的蛋白进行免疫原性分析,为猪圆环病毒亚单位疫苗的开发打下扎实的基础。     

产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

为研究产气荚膜梭菌α、β、ε3种主要外毒素的免疫原性,构建基因亚单位多价疫苗,本研究通过PCR分别扩增α-β2及ε3种毒素基因,分别克隆于p Pro HTa载体中构建重组表达质粒p Pro-α-β2-ε,并转化大肠杆菌进行这3个目的基因的融合表达。SDS-PAGE分析显示,表达的α-β2-ε毒素融合蛋白大小约90 ku,主要以包涵体形式存在。将其免疫BALB/c小鼠后,分别利用A型和B型产气荚膜梭菌强毒素对免疫鼠进行攻毒,并测定免疫鼠血清中抗体对毒素的中和活性。结果表明,免疫鼠对A型和B型产气荚膜梭菌毒素1 LD100和2 LD100的攻毒保护率分别为100%和60%以及100%和80%。体外中和试验显示,免疫鼠血清稀释为1∶20时,对1 LD100A型和B型产气荚膜梭菌毒素的中和效率均可达到100%。以上结果表明,本研究制备的α-β2-ε融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激机体产生中和抗体,可以作为基因工程疫苗的有效组分,为产气荚膜梭菌多价候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

禽多杀性巴氏杆菌强毒株与弱毒株制备的蜂胶灭活疫苗免疫原性的比较试验

用禽多杀性巴氏杆菌强毒株(C48-1)与弱毒株(G190E40和B26-T1200)制备的蜂胶灭活疫苗的免疫原性对比试验结果表明,强毒株C48-1制备的禽霍乱蜂胶灭活疫苗的免疫效果显著高于弱毒株G190E40和B26-T1200,近期保护率相差20%～40%,3个月后相差40%～80%.强毒株C48-1的免疫原性显著高于弱毒株G190E40和B26-T1200,说明禽多杀性巴氏杆菌荚膜上的毒力蛋白可能具有免疫原性.     

新城疫（ND）—减蛋综合征（EDS76）蜂胶二联灭活疫苗的研制Ⅰ．制苗工艺、疫苗安全性和免疫原性试验

将新城疫病毒（NDV）Colon-30株和减蛋综合征病毒（EDS76AV）－127株分别接种于非免疫鸡胚和鸭胚，制备抗原液。抗原液经甲醛灭活后，与纯化的天然免疫增强剂蜂胶乳化，制成鸡新城疫（ND）－减蛋综合征（EDS76）蜂胶二联灭活疫苗，对疫苗的安全性和免疫原性进行了测定。对3－6周龄易感雏鸡以2倍使用剂量肌内注射，安全性良好；对1日龄雏鸡接种1个使用剂量进行急性毒性试验。15d生长曲线表明，对雏难 影响。对6周龄雏鸡注射1个使用剂量，每批疫苗免疫10只鸡，免疫后5－32d，鸡血清中EDS76血凝抑制（HI）抗体的几何平均滴度（GMT）为6．5－11．8log2,ND血凝抑制（HI）抗体的几何平均滴度（GMT）为4．8－9．8log2；对ND免疫攻毒试验表明，3批疫苗，每羽份含有的半数保护量（PD50）分别为≥127、≥131和≥127。     

犬瘟热病毒的静水压灭活

以250MPa的静水压力对犬瘟热病毒（CDV）处理30min之后，CDV被灭活，由其制成的灭活疫苗诱导犬产生中和抗体的能力明显优于传统的福尔马林灭活疫苗，免疫保护率达90％。电镜观察显示，经不同程度静水压力处理后的CDV粒子均发生变形，表面呈现凸起，但CDV H基因部分片段的RT－PCR扩增结果揭示，高达510MPa的静水压力作用30min也未能使其基因片段受到破坏。     

疫病高发鸡群的新城疫支气管炎免疫研究

呼吸道症状较为突出的鸡群,通常为新城疫(ND)和传染性支气管炎(IB)的混合感染,这些地区的鸡群以使用鸡新城疫和传染性支气管炎二联疫苗免疫鸡群为好.问题极为突出的是一些鸡群发病率高死亡率高,表现为新城疫超强毒的状况,这就要求疫苗须有高免疫原性,能控制新城疫避免超强毒感染发生的疫情、稳定鸡群,保障鸡群良好的生产水平.     

减毒鼠伤寒沙门菌在雏鸡体内的安全性与免疫原性研究

通过鸡接种不同剂量的SL8132、SL8786、SL8132/pcDNA3s与SL8786/pcDNA3s,测定其致病力与免疫效果,检测了诱导乙肝表面抗体(抗-HBs)的动态变化.结果表明减毒鼠伤寒沙门菌原菌SL8132、SL8786接种后连续观察雏鸡10d,不同剂量组的感染均未引起死亡.接种后7周,肝脏、脾脏中已没有菌落,粪便中仅有极少量的菌落.口服减毒鼠伤寒沙门菌在完成抗原呈递后即被鸡体免疫系统所清除,未发现雏鸡出现明显毒副作用.SL8132/pcDNA3s与SL8786/pcDNA3s疫苗诱导的抗-HBs动态检测发现,抗-HBs在免疫后水平逐渐升高,到第8周最高,此后逐渐下降.原菌SL8132与SL8786与重组菌株SL8132/pcDNA3s与SL8786/pcDNA3s均具有良好的安全性与免疫原性.     

猪丹毒QL251弱毒株安全性及免疫原性试验

猪丹毒ＱＬ２５１弱毒株是我所保存的猪丹毒强毒菌种Ｃ４３００９的变异株，对其进行了毒力和免疫原性的测定，该菌株毒力原来是３－５个活菌可致死小白鼠，现在对小白鼠皮下注射７．４×１０~８活菌，小白鼠全部健活，对敏感猪皮下注射９．４×１０~（１０）活菌均健活且无任何反应；小白鼠免疫９－１２个活菌７２％保护，对猪免疫２９０－５９０×１０~４活菌１００％保护。     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明，ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）工程菌株可作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株     

伪狂犬病病毒Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区原核表达及免疫原性研究

根据GenBank公布的伪狂犬病病毒GDSH株（EF552427）的gE基因序列设计1对特异引物,对伪狂犬病病毒 Guizhou-DY分离株的gE基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-gE636,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将gE基因主要抗原表位区亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建原核表达质粒pET-32a(+)-gE636,并将其转化至BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约42.7 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定的抗体,该研究为伪狂犬病亚单位疫苗的研究奠定了基础。