鮰爱德华菌外膜微孔蛋白ompN1、ompN2和ompN3基因生物信息学分析及截段基因的原核表达与其抗原性检测

根据GenBank中鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)外膜微孔蛋白N(outer membrane porin protein,OMP)基因序列(NC_012779.2)设计引物,以鮰爱德华菌Ms12基因组DNA为模板,经PCR扩增后克隆至pMD19-T载体,将阳性克隆菌送公司测序。测序结果通过生物信息学软件对ompN1、ompN2和ompN3序列的氨基酸序列相对分子质量、分子式、信号肽、跨膜区、亲/疏水性、B细胞表位进行预测,并构建系统发育树;根据去信号肽的B细胞表位相对集中区域设计特异性引物,经PCR扩增后,将截段序列克隆至pMD19-T载体,鉴定成功后克隆至原核表达载体pET32a(+)并转化至BL21(DE3)/Rosseta(DE3)进行IPTG诱导表达,最后用兔抗鮰爱德华菌血清对重组蛋白OmpN1、OmpN2和OmpN3进行免疫原性检测。结果显示扩增得到ompN1(1 143bp)、ompN2(1 056bp)和ompN3(1 053bp)的序列,获得的基因登录号分别为KJ831564、KJ831565和KJ831566。经生物信息学分析显示,OmpN1、OmpN2和OmpN3蛋白分子式分别为C1940H2993N543O622S7、C1817H2723N497O579S5和C1896H2843N519O563S7,相对分子质量大小分别为44 100、40 900和41 800,均为含有1个信号肽和跨膜区的疏水性蛋白,具有1个革兰阴性细菌OM_channels超家族结构域,是1种嵌入型的膜外蛋白;SDS-PAGE电泳检测发现,诱导表达的融合重组蛋白均以包涵体的形式出现在沉淀中,大小分别约为61 800、58 700和59 100;Western-blot分析表明,重组蛋白OmpN1、OmpN2和OmpN3均能与兔抗鮰爱德华菌全菌血清结合,表明鮰爱德华菌外膜微孔蛋白N具有亚单位疫苗开发的潜力。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2抗原表位区的原核表达及免疫原性分析

试验旨在表达纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2重组蛋白。利用PCR技术扩增获得大小为750 bp的NSP2 226－475位氨基酸编码序列,然后将该序列亚克隆到pET-28a（+）表达载体上,通过pET-28a（+）表达载体在大肠杆菌Rosetta-gami 2（DE3）pLys中得以表达,获得大小为29 ku的重组蛋白,对重组蛋白诱导时间进行优化,SDS-PAGE显示重组蛋白在37 ℃经1 mmol/L IPTG诱导8 h时表达量最大,免疫印迹结果证实表达的蛋白能被PRRSV阳性血清识别,具有良好的免疫原性。本研究成功表达纯化了NSP2重组蛋白,为目标蛋白作为包被抗原建立检测PRRSV血清抗体的ELISA方法奠定了基础。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA毒素蛋白免疫原性分析

为鉴定胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）ApxIA毒素蛋白N端疏水区和C端Ca^2＋结合区的免疫原性，参照apxIA基因序列（D16582）设计4条引物，用于扩增APP血清10型参考菌株（D13039）基因组DNA中长约3．2kb的apxIA基因及其N端（1．4kb）和C端（1．8kb）基因片段，经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达，表达的融合蛋白大小分别约为125Ku、65Ku和80Ku。表达产物免疫小鼠后的攻毒保护试验结果显示，ApxIA表达蛋白对APP血清10型（D13039）攻毒可提供完全保护，而对APP血清1型（4074）攻毒仅能提供部分保护，与提纯的Apx1毒素蛋白免疫保护效果相当；ApxIA-N端表达蛋白免疫保护活性显著高于ApxIA-C端表达蛋白，提示ApxIA蛋白免疫活性位点多位于N端，在Apx1毒素蛋白的保护性抗原活性中发挥更重要作用。     

禽Ⅰ型副粘病毒各种禽源分离株的免疫原性

分别制备了源于鸡、鹅、鸽、鹌鹑、孔雀、画眉鸟、珍珠鸡的禽型副粘病毒(APMV-1)7个强毒分离毒株和商品弱毒疫苗株克隆30(C30)的灭活油乳剂苗,并用这8种灭活油乳剂苗和C30株的活疫苗分别在鸡、鹌鹑、鹅和鸽进行了免疫及交叉攻毒保护试验。免疫后(PI)分别测定试验禽血清的新城疫病毒(NDV)血凝抑制(HI)抗体的滴度,并于PI 5周用强毒株进行攻毒。结果表明,鸽的HI抗体几何平均滴度(MAT)为9.00~10.0 log2,鸡的为7.13~7.63 log2,鹌鹑的为5.00~5.13 log2,鹅对灭活油乳剂苗的为5.63~6.38 log2、而对C30株活疫苗的仅为3.38log2;除了C30株活疫苗免疫鹅提供的保护率比较低(20%)外,8种油乳剂苗都能对同源或者异源强毒株的攻毒提供比较高的保护率(66.75%~100%)。研究结果表明,经典疫苗株C30与近年来从各种不同禽类分离的致病性APMV-1野毒株之间、不同禽源分离株之间的抗原性,以及各种不同禽源分离株的之间的免疫原性差异均不大。     

NDV F48E9株HN基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究

从新城疫标准强毒株F48E9株克隆血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,将HN基因转入昆虫杆状表达系统,转染昆虫细胞Sf9。经Western blot和间接免疫荧光鉴定,该系统成功表达了HN蛋白。重组HN蛋白单次免疫SPF鸡可诱导机体产生较高的抗体水平,为试验鸡提供较好的免疫保护。研究结果用于生产证明该重组HN蛋白可刺激机体产生较强的免疫反应,可用于生产有效的新城疫疫苗。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSV HB-3株GP5、M和N基因,通过Linker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因一起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-M-N免疫Balb/c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体(1∶4),随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高(1∶32)。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

Study on Expression and Preliminary Immunocompetence of CIC Protein Containing Molecular Adjuvants

To express CTB-IsdBid-Clfais(CIC) protein and evaluate its immunogenicity, CTB (as a molecular adjuvant) could be tandem linked with IsdBid-Clfais gene by the overlapping PCR method, then CTB-IsdBid-Clfais(CIC) was inserted into pET-32a(+) vector to construct recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais. The recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais were transformed into Escherichia coli (E.coli) BL21 to express the CTB-IsdBid-Clfa(CIC) protein, the CIC expression protein and its immune activity were detected by Western blotting and ELISA,respectively. The results showed that the length of CIC gene were 2 072 bp, and CIC was correctly inserted into the pET-32a(+) plasmids, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed. Western blotting result confirmed that the molecular weight of CIC proteins was 95.9 ku, which were correctly expressed by E.coli BL21 with pET-32a (+)-CTB-IsdBid-Clfais plasmids. ELISA results showed that there was no significant difference among the CIC, IsdBid and Clfais protein groups (P>0.05), and there was extremely significant difference between CIC and BSA protein groups (P<0.01). In conclusion, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed, CIC proteins were correctly expressed, and were able to react with serum from mice immunized with IsdBid and Clfais,respectively,therefore, CIC proteins had strong immune activity.     

鸡源和鸭源EDS病毒的某些生物学特性比较

对 Ｅ Ｄ Ｓ 病毒鸡源株 （ Ｎ Ｅ４） 和鸭源株 （ Ｊ Ｅ１） 在繁殖动态、毒价、免疫原性、核酸酶切图谱、多肽组成等５ 个方面进行比较研究。结果表明, ２ 株相同血清型、不同宿主来源的 Ｅ Ｄ Ｓ 病毒在普通生物学特性方面基本相同, 但在核酸酶切图谱和多肽组成等分子生物学水平上存在明显差异。     

增强疫苗免疫原性的方法

增强疫苗免疫原性的方法顾天钊，陈怀青综述陆承平审校（南京农业大学动物医学院南京，２１００９５）良好的疫苗应具有以下的特点：安全性好，能产生较强的免疫力，对热稳定，且价格低廉，易于保存。自巴斯德以来，对疫苗的研究迄今未衰。理想的疫苗需要有坚强的免疫保护...