玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞透明带超微结构变化及体外受精效果的影响

本实验采用OPS法玻璃化冷冻小鼠卵母细胞,通过扫描电镜观察透明带表面物理特性的变化。旨在研究冷冻导致小鼠卵母细胞透明带表面超微结构的变化以及冷冻卵母细胞体外受精后胚胎发育率和精子穿透透明带能力的影响。结果表明:冷冻后透明带表面网状结构消退或消失,发生熔融样变化。冷冻组中A型透明带比例(57.14%)显著低于毒性实验组(79.32%)及对照组(81.25%)(P<0.05),而发生熔融样变化的比例显著高于其他两组(P<0.05)。体外受精后,冷冻组的卵裂率和囊胚发育率(60.90%,39.51%)均显著低于毒性实验组及对照组(81.74%,55.72%;87.47%,61.63%)。体外受精4 h,冷冻组透明带平均结合精子数(10.56)与毒性实验组和对照组(10.26,10.21)间均无显著性差异(P>0.05);但受精后对透明带消化处理发现,冷冻组紧密结合精子的平均个数(3.28)与其他两组(5.11,5.21)存在显著性差异(P<0.05)。结果显示,冷冻导致透明带表面物理特性的变化,进而造成受精率下降。     

大花萱草“黄绣客”愈伤组织玻璃化的初步研究

以大花萱草"黄绣客"为试材,研究了培养基中不同成分、光照强度和封口膜的透气性对"黄绣客"愈伤组织玻璃化的影响。结果表明:适当提高琼脂和蔗糖质量浓度,降低硝酸铵以及激素质量浓度,能有效降低"黄绣客"玻璃化现象,激素质量浓度是影响"黄绣客"玻璃化的主要因素;能够有效降低"黄绣客"玻璃化的培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L+蔗糖50g/L+硝酸铵400mg/L;培养期间增强封口膜的透气性和光照强度也能有效降低玻璃化。     

满天星试管玻璃化苗与正常苗的比较研究

以满天星组培正常苗和玻璃苗为材料,通过生理生化特性、同工酶分析,探讨了满天星试管苗玻璃化发生原因。结果表明：玻璃苗组织含水量较高,为95.8%,而正常苗为91.7%。玻璃苗的各种叶绿素平均含量及可溶性糖和还原糖含量分别为正常苗的14.0%,63.8%和86.9%;而玻璃苗的过氧化物酶（POD）的活性增加,是正常苗的2.6倍。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对酯酶同工酶进行分析结果表明,玻璃苗的酯酶同工酶电泳谱带出现缺失的异常现象,同时其谱带颜色较浅;过氧化物同工酶电泳结果表明玻璃苗与正常苗相比活性增加且谱带增多。     

人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的比较

【目的】比较人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的复苏率,建立高效的冷冻保存方法。【方法】利用慢速冷冻、开放式和密闭式玻璃化冷冻3种方法保存人胚胎干细胞克隆,比较这3种方法的复苏效率,并通过免疫组化染色检测复苏后细胞的OCT-4表达。【结果】开放式快速冷冻方法的克隆复苏率为(97.5±5.0)%,密闭式快速冷冻方法的克隆复苏率为(96.7±5.8)%,均极显著高于慢速冻存方法(25.7±4.1)%。解冻后的胚胎干细胞克隆仍然保持胚胎干细胞的特性。【结论】开放式和密闭式玻璃化冻存方法能够高效保存人胚胎干细胞。     

新疆紫草快繁技术研究

[目的]建立新疆紫草组培快繁技术体系.[方法]以新疆紫草无菌苗的茎尖为外植体,筛选适合茎尖萌发、增殖、生根的激素组合.[结果]茎尖最佳萌发培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L,其萌发率为100;.芽增殖培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L,芽增殖倍数为13.50倍,继代壮苗培养基为MS+NAA 0.3 mg/L +6-BA 0.5 mg/L,生根培养基为MS+NAA 0.1 mg/L,生根率为84;.降低6-BA浓度到0.05 mg/L可大幅降低玻璃化发生率.经过此培养基继代后,再在原生根配方中生根,生根率提高到95.32;.[结论]茎尖是新疆紫草快繁的最佳外植体.     

玻璃化法超低温保存荔枝胚性愈伤组织及其植株再生

采用玻璃化法对荔枝胚性愈伤组织超低温保存及植株再生进行了初步探讨.将继代保存15 d的荔枝胚性愈伤组织转接到预培养基[MS+50 mL.L-1二甲基亚砜(DMSO)+1 mg.L-12,4-D+20 g.L-1蔗糖+6 g.L-1琼脂糖]中,在5℃低温下预培养.将预培养后的愈伤组织于常温下用体积分数为60%玻璃化溶液(2PVS2)装载20 min,再于0℃下用PVS2溶液平衡40 min;换新鲜的PVS2溶液,迅速投入液氮中保存.1周后取出,于40℃温水浴中化冻,弃PVS2,用1.2 mol.L-1蔗糖液+MS基本培养基的洗涤液洗涤3次,再接种到新鲜的培养基中恢复培养,恢复培养后的胚性愈伤组织能正常进行体细胞胚胎发生、成熟和植株再生.     

玻璃化冷冻对猪MII期卵母细胞发育能力的影响

以MII期卵母细胞作为试验材料,应用玻璃化冷冻方法,就目前应用最多的7组冷冻保护液配方进行筛选,并且比较3种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果。结果发现:7组冷冻保护液对MII期卵母细胞有低毒性作用,各组分裂率、囊胚率、囊胚细胞数均低于对照组;综合各组指标,选取3组对猪MII期卵母细胞的发育能力损伤最小的冷冻保护剂,应用GMP管对其冷冻保护效果进行比较,发现第7组冷冻保护液配方EFS不适于MII期卵母细胞的冷冻,其形态正常率、分裂率分别为1.19%、0,与第3组、第6组形态正常率、分裂率(59.48%、53.55%;24.19%、35.02%)差异显著(P0.05)。综合考虑,选取HM+7.5%(DMSO+EG),HM+17%(DMSO+EG)+0.4 mol/L Su作为冷冻保护剂来比较3种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果差异,发现半麦管冻融后MII期卵母细胞的分裂率高达53.67%,与OPS法的29.33%及GMP法的35.00%相比差异显著(P0.05),半麦管法更适合MII期猪卵母细胞的玻璃化冷冻。     

玻璃化超低温保存中拟南芥幼苗细胞膜ATPase的变化

运用氯化铈 (CeCl3)沉淀的电镜细胞化学方法 ,研究了玻璃化超低温保存中拟南芥 (Arabidopsisthaliana)不同苗龄幼苗细胞ATPase活性变化及玻璃化保护处理对酶活性的影响 .种子萌发 48h形成的幼苗 (2d龄幼苗 )细胞膜ATPase活性反应强于种子萌发 72h形成的幼苗 (3d龄幼苗 ) ,但直接投入液氮 (LN2 )冻融后 ,2d及 3d龄幼苗的ATPase全部失活 .玻璃化技术保护处理后 ,2d及 3d龄幼苗ATPase活性有不同程度提高 .2d龄幼苗经玻璃化处理后ATPase活性明显提高 ,细胞膜ATPase在随之的LN2 冻融后仍保持了较高活性 ;3d龄幼苗经玻璃化处理后ATPase活性稍有提高 ,但LN2 冻融后酶活性丧失 .幼苗玻璃化超低温保存结果显示 ,2d及 3d龄幼苗直接投入LN2幼苗全部死亡 .玻璃化处理后再投入LN2 ,2d龄幼苗有 76 %的成活率 ,而 3d龄幼苗仍然全部死亡 .结果表明 ,幼苗细胞膜ATPase活性与幼苗耐受LN2 冻融后的成活率相关联 .玻璃化处理可以提高幼苗细胞膜ATPase活性 ,对 2d龄幼苗抗LN2 冻融伤害有保护作用     

玻璃化冷冻体外成熟牛卵母细胞的尝试

通过两个试验对体外培养成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻。试验１用１０％丙二醇（ＰＧ）加上不同浓度（０％～２０％）的乙二醇（ＥＧ）作为细胞内玻璃化溶液（ＶＳ１），２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为细胞外玻璃化溶液（ＶＳ２）对卵母细胞进行冷冻。结果卵母细胞的体外受精分裂率（０．９％～２３．４％）均显著低于对照组（７５．０％）。在处理组中，以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ和１０％ＰＧ＋１０％ＥＧ作为ＶＳ１的效果较好，分裂率分别为２３．４％和２２．２％，均显著高于其他处理组。试验２以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ作为ＶＳ１，２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为ＶＳ２进行冷冻。解冻后在０．５ｍｏｌ／Ｌ或０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中１～２步或在含防冻剂的溶液中经２～３步稀释防冻剂。卵母细胞经体外受精后，分裂率在１８．２％～３０．６％之间。在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中一步脱防冻剂的卵母细胞经体外受精、体外培养后，２５个早期胚胎中有３个发育成囊胚，其它组均未发现囊胚。这些结果表明玻璃化过程对卵母细胞造成了损伤。引起损伤的原因可能是玻璃化溶液的化学毒性作用及脱防冻剂过程中卵母细胞受到的渗透压损伤。     

小尾寒羊羔羊超数排卵及卵母细胞玻璃化冷冻保存效果研究

以我国地方品种小尾寒羊作为供体,对不同年龄羔羊(6～8周龄和12～14周龄)超数排卵效果以及卵母细胞冷冻保存对体外受精、体外胚胎发育、胚胎移植产羔的影响进行研究。结果表明:6～8周龄组羔羊只均超排处理获卵数和可用卵数(60.8枚和58.2枚)显著高于12～14周龄组(27.3枚和26.0枚)(P<0.05);经玻璃化冷冻—解冻后的卵母细胞体外受精,冷冻组的卵裂率和桑椹胚发育率(67.8%和35.6%)均显著降低于对照组(79.2%和53.8E)(P<0.05);玻璃化冷冻保存体外生产的胚胎,经移植后成功产下4只健康羔羊(4/52)。