玉米特异启动子驱动下结核hsp65基因植物表达载体构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-Hsp65联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。结果表明：成功构建了pC1300GHsp65质粒,酶切鉴定得到3 Kb和8.6 Kb两条带,测序分析表明,克隆的Hsp65与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒条带大小与预期结果相符合。结果显示,已成功构建和转化了pC1300GHsp65质粒,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础。     

家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析

【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。     

水稻基因启动子Ospz1的克隆与表达特性研究

在水稻基因组芯片分析的基础上,克隆到一个在水稻中高水平表达基因OsSG15'末端启动子区域1.6-kb的DNA片断,即Ospz1启动子,构建了由Ospz1启动子引导的GUS重组基因,并经农杆菌介导将重组基因导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性测定结果表明,Ospz1启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片、芽和根中高效表达,而在其它器官中不表达或表达活性极弱,表现出组织特异性.Ospz1启动子可用于农作物生物技术的遗传改良.     

水稻蜡质合成相关基因 OsCER4 自身启动子驱动的反义RNA转化植株获得

水稻OsCER4基因编码脂肪醛脱羧酶,与拟南芥CER1基因高度同源,是否参与植物表面蜡质合成尚不清楚,为了探讨其功能,扩增了OsCER4基因起始密码子ATG上游约2 kb的序列作为该基因的启动子,以常规技术将启动子和OsCER4基因反义片段克隆到pCAMBIA双元载体1380中,采用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11,并进行了转化苗OsCER4蛋白的表达量变化分析.结果表明,成功构建了由OsCER4自身启动子驱动的反义RNA载体,并通过农杆菌介导法成功转入水稻中花11中,多数OsCER4基因反义转化植株为阳性转化植株,后代分离比符合3∶1,反义RNA转化植株在蛋白水平上的表达量下降.     

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

绵羊高硫角蛋白启动子表达活性研究

角蛋白是羊毛主要结构蛋白,为了筛选在绵羊毛囊中具有高表达活性高硫角蛋白的内源启动子,本研究以绵羊基因组为模板,克隆得到高硫角蛋白基因启动子B2C,将B2C与去除CMV启动子的pAcGFP1-N1载体连接,构建了重组真核表达载体。采用阳离子脂质体法转染传代培养的绵羊成纤维细胞和去除透明带的小鼠4细胞期胚,分析其表达活性。结果表明,转染后48 h,在蓝光激发条件下可以检测到绵羊成纤维细胞核内及核周围绿色荧光蛋白的高表达,转染72 h后,在核内表达减弱,而细胞质内表达增加;此外,虽然利用病毒启动子构建的GFP表达载体能够在小鼠的早期胚胎细胞中表达,但由B2C启动子与GFP构建的表达载体转染小鼠早期胚胎后,未观察到绿色荧光,表明B2C启动子在绵羊成纤维细胞中具有表达活性,但不能在小鼠早期胚胎中表达。     

拟南芥HPT1,VTE3及TE4基因启动子在逆境条件下的表达特性分析

维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素,具有重要的生理功能。尿黑酸叶绿醇转移酶（HPT）、2-甲基-6．叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQMT／VTE3）、1-生育酚甲基转移酶（γ-TMT／VTE4）是维生素E生物合成途径中的关键酶。本研究对来自拟南芥的HPT1,VTE3,VTE4三个基因启动子在低温、高盐及无光等逆境条件下的表达特性进行了分析,GUS组织化学染色结果表明：低温条件下,HPT1的表达降低明显,高盐条件下,HPT1的表达仅略有降低,无光条件下HPT1在茎中的表达升高,而根中的表达则降低;低温条件下VTE3的表达没有变化,高盐条件下则明显降低,无光条件下VTE3在茎中的表达显著降低;低温条件下VTE4表达略有升高,高盐条件下其表达明显降低,无光条件下VTTE4在茎中的表达有所降低。说明拟南芥维生素E合成途径中的酶的表达受外界环境条件的影响。     

酪蛋白和巨细胞病毒复合启动子激活人乳铁蛋白cDNA基因在转基因小鼠乳腺中的表达

为了提高转基因动物乳腺特异性表达水平,构建了两种不同启动子的乳腺特异性表达载体,以比较其乳腺特异性表达效果.应用山羊β-酪蛋白或牛αs1-酪蛋白调控序列、鸡β-球蛋白隔离元件、巨细胞病毒(CMV) 基因表达涮控元件构建了,乳腺特异性表达复合启动/增强子(Pcmv) ,以单一的酪蛋白启动子作为对照,与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体,并制备了转基因小鼠.经ELISA检测,复合启动/增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白(rhLF) 表达水平(2.0～8.1 g·L-1) 明显高于单一酪蛋白启动子构件(0～12 mg·L-1) ,而在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测到rhLF.结果提示:酪蛋白-Pemv复合启动/增强子不仅可提高转基因小鼠乳腺特异性表达水平,而且具有良好的乳腺表达特异性.