S1核酸酶突变检测法的优化

功能基因组学研究需要高通量的突变检测方法,S1核酸酶法就是其中一种,具有简单、费用低等优点,但由于该酶酶反应条件难以控制,很容易发生非特异性切割。本文以已知插入突变的玉米叶绿素a/b结合蛋白基因的启动子为对象,优化了该突变检测体系,基本研究清楚了导致S1核酸酶非特异性降解双链DNA的原因。     

Fractionation of Soluble Copper- and Zinc-Binding Proteins From Cattle Liver

The distribution of copper and zinc among soluble proteins in liver from normal slaughter cattle was examined after gel filtration of the proteins. Gopper- and zinc-binding proteins were mainly separated into three fractions. Varying amounts of zinc were eluted in a fourth fraction of molecular weight less than 2,000. A clear relationship was noted between the amount of copper bound to the low molecular weight fraction (m.w. ~ 10,000) and the total liver zinc concentration. The high molecular weight protein fraction (m.w. > 65,000) dominated in liver with zinc concentrations below 40 µg/g wet weight and total copper concentrations from 16 to 240 µg/g, while in liver with zinc concentrations above 40 µg/g and copper concentrations ranging from 20 to 107 µg/g, the low molecular weight metallothionein-like fraction dominated.     

钠盐胁迫对小麦叶片核酸损伤和多胺积累的影响

采用室内培养、测定方法研究不同浓度的NaCl,Na2SO4和Na2CO3胁迫对小麦(Triticumaestvum)叶片H2O2、核酸代谢和多胺影响。结果表明,在钠盐胁迫下H2O2含量随着胁迫浓度的增加而增加,其中Na2CO3胁迫下H2O2含量增加最显著。核酸含量随着胁迫浓度的增加而减少,且RNA含量变化明显大于DNA,而核酸酶的活性在低浓度胁迫下升高,高浓度胁迫下降低,证实钠盐胁迫主要影响核酸的合成,其中对小麦叶片RNA的影响明显大于对DNA的影响。多胺亦随之积累,Na2CO3胁迫下多胺积累最显著,且变化量为腐胺(Put)>精胺(Spm)>亚精胺(Spd);高钠盐胁迫下多胺积累不明显,其中腐胺在200mmol·L-1下反而减少。     

锌指核酸酶(ZFN)介导的牛肌肉抑制素基因(MSTN)突变的研究

肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉发育的负调控基因,突变后会引起肌肉的过度发育,在肉用动物育种中有非常重要的价值。本研究利用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)对牛(Bos taurus)MSTN基因的第二外显子特异性剪切,诱导该基因的突变,从而达到敲除该基因的目的。首先对脂质体介导的双质粒共转染牛成纤维细胞的条件进行优化,获得的共转染效率高达19.27%;之后利用两组ZFNs对牛成纤维细胞进行转染,单细胞通过口吸法移入96孔板,经扩大培养后进行PCR筛选,获得18株MSTN基因突变细胞株,其中包括一株双等位基因敲除的细胞系,两组ZFNs对牛成纤维细胞的突变效率分别为6.05%和3.84%;最后,挑选一株突变细胞系进行体细胞核移植研究,共获得24枚重构胚;将去除透明带的重构胚培养于2i培养液中,获得囊胚来源的类滋养层干细胞,通过PCR和测序检测,证明该细胞系在MSTN基因第二外显子具有与供体细胞相同的突变。结果表明,所合成的两组ZFNs可以在MSTN作用位点引起突变,具有很高的突变效率,而且能获得双等位基因突变的细胞株,获得的细胞株能够用作体细胞核移植的供体细胞。本研究为肉用牛的品质改良和育种工作提供了基础资料。     

三种单链特异性核酸酶检测桉树ESTP的酶切条件优化

单链特异性(SSS)核酸酶是基因组学研究的有效工具.本研究对绿豆芽核酸酶、S1和芹菜汁提取物三种SSS核酸酶检测桉树ESTP检测的酶切条件进行了优化,优化因子依次包括Mg2 浓度、酶切温度、酶用量和/或pH值等因子.三种酶的最适酶切温度均为60℃.绿豆芽核酸酶优化后的酶切反应体系为:10×Buffer(pn 5.56)1.0 μL(NaAc 300 mmol/L,Nacl 1.0 mol/L,ZnAc2 10 mmol/L,甘油50%,MgCl2 100 mmol/L),PCR产物5 μL,酶4.5 U,超纯水补至10 μL;S1的优化酶切体系为:10×Buffer(pH 5.46～3.67)1.0 μL(MgCl2100 mmol/L,ZnAc2 2 mmol/L,Bis-Tris 200 mmol/L,Triton X100 0.02%,BSA 0.002 mg/mL),PCR产物5 μL,S1酶5 U,超纯水补至10 μL;CJE的优化酶切体系为:10×Buffer(pH 7.5)1.0 μL(MgCl2 100 mmol/L,Hepes100 mmol/L,KCI 100 mmol/L,Triton X100 0.02%,BSA 0.002 mg/mL),PCR产物5.0 μL,CJE酶1.0 μL,超纯水3.0 μL.综合考虑酶切效果和成本,推荐S1为检测桉树ESTP的经济、有效的SSS核酸酶.     

猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响

旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响.采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性,同时,分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影响以及胞外产物对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响.猪霍乱沙门菌胞外产物具有降解λDNA的DNA酶活性,...