细菌λ Red重组技术的应用及其影响因素

由λ噬菌体的exo、beta、gam 3个基因分别编码的Exo、Beta和Gam蛋白组成λRed同源重组系统。λRed重组是细菌靶基因置换的有效技术,该技术发展迅速,已广泛应用于大肠埃希菌等细菌染色体DNA的基因敲除、基因整合,可以对任何大小的DNA分子进行精确修饰。利用λRed重组系统不仅可以构建工程菌,还可以为研究细菌的致病机理和耐药机制提供新的方法。然而,许多应用因重组频率而受到限制,影响重组频率的因素主要有底物浓度、同源片段的长度、内源性核酸酶、错配蛋白等。论文综述了λRed同源重组技术的应用进展及影响重组的因素,以期为优化重组试验方案及提高试验的成功率提供帮助。     

锌指核酸酶技术在动物转基因研究中的应用

锌指蛋白核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)是一种人工合成酶,含有锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域,因其能特异性识别并切割DNA序列及其可设计性而被用基因定点突变和外源基因定点整合。这项技术已应用于转基因动物研究中。本文综述了锌指核酸酶技术在转基因研究中的应用进展,并对锌指核酸酶技术的应用前景进行了展望。     

锌指核酸酶及其应用研究进展

锌指核酸酶由锌指和非限制性切割酶两部分组成,锌指能特异性结合基因组双链DNA,非限制性切割酶能造成染色体上双链DNA的断裂,通过机体的修复机制可以使目的基因突变或外源基因插入,进而应用于转基因动物的制备.综述了锌指、切割酶及采用锌指核酸酶制备转基因动物的研究进展,主要包括锌指的发现、结构及与DNA结合时的碱基分布和结合方式,锌指的筛选和设计方法;切割酶的研究进展包括FokⅠ的发现及切割特点,基因修饰后的异源二聚体切割特异性等.     

三种方法检测口蹄疫146S抗原含量及抗原稳定性的比较研究

为比较三种口蹄疫146S抗原含量检测方法,分别用蔗糖密度梯度离心结合安捷伦Cary 100紫外分光光度计定量法、蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法及高效液相体积排阻色谱法三种检测方法,对口蹄疫灭活抗原中的146S含量进行检测,对三种检测方法的数据进行统计分析。将口蹄疫A型抗原和O型抗原各一株分别4℃放置12个月以及反复多次冷冻处理;口蹄疫抗原用全能核酸酶处理,然后用蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法检测处理前后的146S抗原含量变化。结果显示,三种检测方法的检测数值相关性极显著,呈正相关性;4℃放置12个月后的抗原含量没有变化,而反复多次冷冻处理后的抗原含量降解非常多;全能核酸酶处理后的抗原杂蛋白含量少。研究表明,基于临床需求,蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法更适合口蹄疫抗原检测;口蹄疫抗原适合于4℃保存;全能核酸酶能有效去除杂蛋白干扰,提高色谱纯化效率。     

锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用

锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)具有特异性识别并敲除DNA片段中特定基因的特点,通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞,是能够应用于动物转基因上的一种新技术.该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果,相对于传统的转基因技术,该技术在简化操作程序、缩短操作时间及提升成功率上都有很大的提高.就常用的动物转基因方法、锌指核酸酶技术的作用原理以及在动物转基因上的应用及其前景进行了论述.     

PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌

为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法,依据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列,设计合成特异性引物,通过聚合酶链式反应扩增Nuc基因,并将扩增基因克隆入T载体,进行序列测定,对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定.结果显示:金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带,大小为694bp;其他菌株未出现条带.敏感性检测的最低浓度为1.25×103 cfu/mL.本试验所建立的方法具有特异性强、敏感度高的特点.     

PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌

为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法,依据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列,设计合成特异性引物,通过聚合酶链式反应扩增Nuc基因,并将扩增基因克隆入T载体,进行序列测定,对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示:金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带,大小为694bp;其他菌株未出现条带。敏感性检测的最低浓度为1.25×103cfu/mL。本试验所建立的方法具有特异性强、敏感度高的特点。     

核酸酶基因LoENDONUCLEASE 1在东方百合花朵衰老过程中的功能分析

为明确百合（Lilium spp.）花朵衰老发生的分子机制，在东方百合‘西伯利亚’（Lilium oriental hybrid ‘Siberia’）花被片中克隆了一个衰老相关基因LoENDONUCLEASE 1（SAG10），利用qRT-PCR进行基因表达分析，并通过农杆菌介导的拟南芥稳定表达系统和百合花被片瞬时表达体系验证LoENDONUCLEASE 1基因功能。结果显示，LoENDONUCLEASE 1基因开放阅读框（ORF）为921 bp，编码306个氨基酸；LoENDONUCLEASE 1在百合花朵和叶片的衰老过程中特异表达，且受到脱落酸和水杨酸的诱导；拟南芥过表达LoENDONUCLEASE 1株系中叶片叶绿素含量显著低于对照株系，百合花被片中瞬时过表达LoENDONUCLEASE 1基因加速了百合花被片的衰老，且过表达花被片中丙二醛和离子渗透率含量显著高于对照。结果表明，LoENDONUCLEASE 1具有促进花朵和叶片衰老的功能。     

琼脂糖凝胶电泳在水稻EcoTILLING技术中的应用

为构建低成本的基于琼脂糖凝胶电泳的EcoTILLING技术体系,用于水稻及其他生物自然群体变异的检测,对基于琼脂糖凝胶的EcoTILLING技术进行了优化。结果表明,从芹菜中提取的CEL Ⅰ核酸酶粗提物结合琼脂糖凝胶电泳检测技术,可以成功地检测到目的基因位点的突变。利用该技术,在云南地方水稻品种大吊糯中检测到2 个SNPs。