一种挑取重组子克隆的简易方法

本研究应用菌落ＰＣＲ 方法挑取重组子克隆,简单易行,可减少提取质粒的工作量,使繁重的实验工作得以简化。     

杉木无性系扦插繁殖生根机理

杉木穗条不定根的发生属于诱性根原始体型。不定根发生部位有两种类型：皮层生根型和混合生根型，但以皮层生根型为主。不同无性系开始发根时间有显著差异。在观察期内，发根最早的无性系生根时间为２３ｄ。     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因反义表达载体的构建

本实验用设计好的两条75bp的长引物进行PCR反应，扩增出甜瓜PGl基因的128bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体中，筛选反向克隆，然后将其反向构建到植物表达载体pUC38-ACC的CaMV35S启动手和TMV增强子“Ω”的下游，构建成反义表达载体pUC38-PGo用PCR鉴定重组子，并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体，为用花粉管法将其导入河套蜜瓜，培育转基因耐储河套蜜瓜奠定了基础。     

草鱼HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)序列(AY120894)设计并合成一对引物,以草鱼(Cteno-pharyngodon idella)肝胰脏组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得草鱼HSP70基因cDNA部分序列,并进行了组织表达差异性研究。结果显示:所获为序列为480 bp,获得GeneBank登陆号为FJ483832。序列测序结果显示,HSP70扩增序列与鲤、斑马鱼、鲋的同源性为:93%、91%、93%。另外,所获序列HSP70在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝胰脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达存在差异,HSP70在草鱼这12个组织中均检测到表达,其中在鳍中表达最高,极显著高于其他组织(P<0.01);在鳔中表达次之,且与脑、心脏、性腺中表达差异不显著;在粘液中表达最低。     

香草兰VpLFY基因的克隆与表达分析

花分生组织特征基因LEAFY在植物花芽分化与成花诱导途径中起着重要的调控作用。通过RACE方法从香草兰中克隆VpLFY基因的全长cDNA序列。结果显示,该基因包含一个1 493 bp的开放阅读框,编码491个氨基酸残基。经蛋白质序列同源比对分析结果发现,VpLFY属于FLO-LFY家族。组织特异性研究结果表明,VpLFY基因在香草兰组织中属于组成型表达。荧光定量分析结果表明,VpLFY基因分别在香草兰纯花芽和混合花芽的不同发育阶段中有着较强的表达。     

辣椒抗根结线虫基因Me3的精细定位

 以含Me3基因的抗根结线虫辣椒自交系‘HDA149’为父本,感根结线虫辣椒自交系‘8214’为母本,构建了一个2 133株的F2作图群体。采用群体分离分析法（Bulked Segregant Analysis,BSA）,构建抗、感病两个DNA池,对由两亲本筛选出来的285对引物进行扩增分析,发现引物SSCP_B322和EPMS658在抗、感池间具有稳定的多态性。继续用这两对引物对F2单株进行扩增,以JoinMap 3.0软件分析发现SSCP_B322和EPMS658标记位于Me3基因两侧,遗传图距分别为0.56 cM和1.33 cM。运用回交群体BC1和F3群体验证实了这两个标记,可有效用于辣椒抗线虫分子标记辅助育种,也为图位克隆Me3基因奠定了基础。     

马-牛无透明带卵异种克隆的研究

 【目的】开展异种克隆,为濒危动物的保护、细胞核重编程与核质互作研究提供新途径。【方法】以马耳成纤维细胞为供体,牛卵母细胞为受体,采用无透明带手工克隆方法构建异种胚胎,比较不同的激活液、培养液、体细胞同期方式、核移植方法对马-牛异种克隆胚胎体外发育的影响。【结果】（1）A23187 + 6-DMAP联合激活获得的克隆胚胎发育较好,囊胚率2.60%;（2）克隆胚胎于mCR1aa中的卵裂率和桑葚率显著高于CR1aa和SOF（83.65%vs 77.49%,74.87%;22.36%vs19.37%,18.98%,P＜0.05）,且发育到囊胚（2.72%）,CR1aa与SOF间无显著差异;（3）供体细胞经血清饥饿或接触抑制处理后,获得的异种克隆胚的融合率、卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（4）无透明带手工克隆法的融合率显著高于显微注射法（90.33% vs 72.94%）,卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（5）马-牛异种克隆胚与牛同种克隆胚比较,融合率和卵裂率无差别,桑葚率和囊胚率有显著差异（21.78%vs63.52%;2.71%vs37.48%）。【结论】牛卵母细胞能支持马体细胞去分化,进行核重编程。但由于二者的物种距离较远,异种克隆胚胎的发育能力远低于同种克隆胚胎。     

中规模推广级橡胶树优良品种热研7—33—97的选育

热研7—33—97是一个速生高产抗性较强的橡胶树优良品种。两院试验场高级试验区头9个割年的鉴定结果,其平均干胶产量为4.35千克/株·年、1910千克/公顷·年,分别为对照RRIM600的131.8％和169.5％,干胶含量高,产胶潜力大,干胶性能好,抗风、抗寒能力都优于RRIM600,1993年被评为中规模推广级品种。     

巴西橡胶树锌指蛋白基因的克隆及功能鉴定

锌指蛋白是一类能与DNA/RNA结合并调控基因表达的蛋白。前期笔者通过酵母双杂技术筛选到1个可能与JAZ蛋白互作的巴西橡胶树锌指蛋白(命名为Hbzinc-finger),该基因的c DNA全长序列有2 262bp,编码753个氨基酸。该蛋白碳末端有1个PB1结构域,在336~381处氨基酸序列编码1个Zn F_ZZ锌离子结合结构域。红色荧光蛋白亚细胞定位结果表明,Hbzinc-finger定位于细胞核,酵母自转录激活显示该蛋白有自转录活性。该基因的表达受创伤影响,表明橡胶锌指蛋白的表达可能受茉莉酸信号调控。