猪瘟病毒E2蛋白研究进展

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种急性、接触性传染病。目前该病流行于除北美洲和大洋洲以外的其他大洲和地区,呈世界性分布,在一些原已宣布消灭猪瘟的欧洲国家（荷兰、比利时、英国、德国、意大利、西班牙等）又相继复发。虽然我国长期坚持全面接种猪瘟兔化弱毒疫苗,但目前猪瘟在我国依然存在,流行特点从以往的频发大面积流行转变为无规律区域性的散发,隐性持续性感染病例增多,因此应明确猪瘟病毒的基因组结构和最具免疫防制研究价值的抗原蛋白结构,为研制新型有效的疫苗和诊断试剂提供理论依据。本文就猪瘟病毒的基因组结构、猪瘟病毒E2蛋白的结构、功能、所包含的抗原表位以及E2蛋白的表达应用等方面的研究进展作以综述。     

应用重组杆状病毒表达猪瘟病毒糖基化EO(Erns)蛋白

通过PCR方法扩增出包含糖基化信号肽的猪瘟兔化弱毒疫苗株E0 (Ems)蛋白基因,末端引入6×His标签序列,将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统pFastBacTM HT B载体中,将阳性重组质粒pF-E0转化DH10Bac感受态大肠杆菌,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组Bacmid质粒(rBac-E0).转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rAc-E0.经Western blot鉴定重组蛋白正确表达,且具有良好的抗原性;用糖苷酶PNGase F处理后重组蛋白分子量减小为32 ku,表明重组蛋白为糖基化蛋白.这为进一步研究E0蛋白的功能、亚单位疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础.     

猪瘟病毒E2蛋白与猪RACK1相互作用的鉴定

为筛选和鉴定与猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白相互作用的猪宿主蛋白,我们采用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞表达文库得到与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞RACK1蛋白,经共转化试验和GST pull-down试验进一步证实两者可以特异性结合,并且共聚焦试验表明两者共定位于细胞的细胞浆。本研究显示E2蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,RACK1在CSFV感染过程中所发挥的功能有待进一步研究。     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增，其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段。经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定，并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明，所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高，而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低，基因型差异比较明显，并不归属于同一个基因亚群。本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列的氨基酸序列分析，揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景。     

猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。     

猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。     

23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析

用RT－PCR及测序获得了17株猪瘟病毒（HCV）215bp的E2基因主要抗原编码区序列，经DNAStar软件对获得的17株HCV及已发表的6株HCV毒株序列进行了比较和分析，并构建了HCV遗传发生树。结果，这23株与石门株的序列相比，所有毒株的碱基变化随机地分布于整个序列，无缺失和插入，其中变化较大的区域位于序列的3’端。23株HCV E2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别74．1％－100％、79．7％－100％，其中4株20世纪70－80年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为76．3％－86．2％、81．1％－87．8％，10株20世纪90年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为75．4％－100％、79．7％－100％。所绘制的遗传发生树分为2个组群（group），每个组群分为2个亚组群（subgroup），14株猪瘟（HC）流行毒株在2个组群中均有分布，20世纪70－80年代分离的3株（75％）在组群2，20世纪90年代分离的5株（50％）在组群1。     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒E2基因部分核苷酸序列的遗传进化关系的研究

本研究利用RT-PCR及测序获得了16株猪瘟病毒E2基因部分核苷酸序列。利用DNAStar软件对其6株已发表的猪瘟病毒毒株序列进行了比较和分析，构建了猪瘟病毒遗传发生树。结果可以看出所绘制的遗传发生树分为2个组群，每个组群分为3个亚组群。13株猪瘟流行毒在2个组群中均有分布，猪瘟石门系强毒和C株属于同一组群、同一亚组群。70～80年代分离的4株猪瘟病毒755和Alfort株（法国）在同一组群，25%和Brescia株（意大利）是同一组群，90年代分离的9株猪瘟病毒33.3%和Alfort株（法国）在同一组群，66.7%和Brescia株（意大利）是同一组群。13株猪瘟流行毒株中7株和C株在同一组群，其中70～80年代的1株，90年代的6株。其余的6株猪瘟流行毒株均在另一组群。不同地区及不同材料C-株疫苗的E2基因的核苷酸序列有一定的差异，GPE株与中国的C株有较近的遗传进化关系，而法国的Thiverval株则与中国C株的遗传进化关系较远。本研究的结果对了解我国猪瘟分子流行病学的特点具有重要的意义。