拟南芥抗病基因克隆的策略及利用

生物技术的快速发展为植物抗病基因的克隆奠定了坚实的基础。克隆抗病基因不但有利于深入研究植物与病原物的分子互作机理,而且为植物重要病害的防治提供了有效措施。迄今为止,在拟南芥中已经克隆了十几个抗病基因。对拟南芥抗病基因的种类和特性、克隆策略以及克隆抗病基因的应用前景进行了综述。详细介绍了定位克隆技术和转座子标签技术的原理及其在拟南芥抗病基因克隆中的应用。     

拟南芥HPT1,VTE3及TE4基因启动子在逆境条件下的表达特性分析

维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素,具有重要的生理功能。尿黑酸叶绿醇转移酶（HPT）、2-甲基-6．叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQMT／VTE3）、1-生育酚甲基转移酶（γ-TMT／VTE4）是维生素E生物合成途径中的关键酶。本研究对来自拟南芥的HPT1,VTE3,VTE4三个基因启动子在低温、高盐及无光等逆境条件下的表达特性进行了分析,GUS组织化学染色结果表明：低温条件下,HPT1的表达降低明显,高盐条件下,HPT1的表达仅略有降低,无光条件下HPT1在茎中的表达升高,而根中的表达则降低;低温条件下VTE3的表达没有变化,高盐条件下则明显降低,无光条件下VTE3在茎中的表达显著降低;低温条件下VTE4表达略有升高,高盐条件下其表达明显降低,无光条件下VTTE4在茎中的表达有所降低。说明拟南芥维生素E合成途径中的酶的表达受外界环境条件的影响。     

Formation of wall openings in root cells of Arabidopsis thaliana following infection by the plant-parasitic nematode Heterodera schachtii

The induction and differentiation of feeding structures (syncytia) of the cyst nematode Heterodera schachtii in roots of Arabidopsis thaliana is accompanied by drastic cellular modifications. We investigated the formation of cell wall openings which occurred during syncytium differentiation. At the beginning of syncytium induction, a callose-like layer was deposited inside of the wall of the initial syncytial cell (ISC). First wall dissolutions developed by gradual widening of plasmodesmata between the ISC and neighbouring cells. As a general thickening of syncytial cell walls blocked existing plasmodesmata, other large openings were formed by enzymatic dissolution of intact walls by putative cellulase activity.     

玻璃化超低温保存中拟南芥幼苗细胞膜ATPase的变化

运用氯化铈(CeCl3)沉淀的电镜细胞化学方法, 研究了玻璃化超低温保存中拟南芥(Arabidopsis thaliana)不同苗龄幼苗细胞ATPase活性变化及玻璃化保护处理对酶活性的影响. 种子萌发48 h形成的幼苗(2 d龄幼苗)细胞膜ATPase活性反应强于种子萌发72 h形成的幼苗(3 d龄幼苗),但直接投入液氮(LN2)冻融后,2 d及3 d龄幼苗的ATPase全部失活. 玻璃化技术保护处理后, 2 d及3 d龄幼苗ATPase活性有不同程度提高. 2 d龄幼苗经玻璃化处理后ATPase活性明显提高,细胞膜ATPase在随之的LN2冻融后仍保持了较高活性;3 d龄幼苗经玻璃化处理后ATPase活性稍有提高,但LN2冻融后酶活性丧失. 幼苗玻璃化超低温保存结果显示,2 d及3 d龄幼苗直接投入LN2幼苗全部死亡. 玻璃化处理后再投入LN2,2 d龄幼苗有76%的成活率,而3 d龄幼苗仍然全部死亡. 结果表明,幼苗细胞膜ATPase活性与幼苗耐受LN2冻融后的成活率相关联. 玻璃化处理可以提高幼苗细胞膜ATPase活性,对2 d龄幼苗抗LN2冻融伤害有保护作用.     

拟南芥DA1-Related Protein 2基因参与调控植物对盐胁迫的响应

土壤盐渍化是目前农业生产面临的主要问题之一,同时种子萌发转绿作为植物幼苗形态建成的基础对盐胁迫最为敏感。本研究以Col-0、Ler野生型拟南芥和osr1短根突变体拟南芥为试验材料,通过图位克隆方法得到调控根生长的DAR2(DA1-Related Protein 2)基因。本研究利用RT-PCR方法,发现生长10 d的Col-0幼苗在200 mmol·L 1氯化钠条件下处理6 h和12 h,DAR2基因受盐胁迫诱导;200 mmol·L 1氯化钠处理后,组织化学染色结果显示,萌发1 d的根尖韧皮部和3 d的叶片pDAR2::GUS的表达上升,进一步表明DAR2基因受到盐胁迫的诱导。统计不同MS培养基[0(CK)、100 mmol·L 1氯化钠、150 mmol·L 1氯化钠、200 mmol·L 1氯化钠、150 mmol·L 1氯化钾、200 mmol·L 1甘露醇]上Col-0和dar2-3的萌发率和转绿率发现:随着氯化钠浓度的逐渐增大,突变体无论萌发还是转绿时间明显比野生型晚。在150 mmol·L 1氯化钾和200 mmol·L 1甘露醇培养条件下,萌发和转绿的时间也比野生型要晚。这些结果表明突变体在萌发和转绿期对盐胁迫的敏感性比野生型明显增强,进一步证明了突变体对盐胁迫的敏感性并不是对离子的特异响应。这些研究结果为深入了解逆境胁迫下植物早期生长发育的可塑性调控机制奠定了基础,同时也为通过生物技术改良作物抗逆性提供了理论依据。     

花生种子特异启动子AHSSP1的克隆及功能分析

为丰富花生种子特异启动子资源,本研究利用PCR技术在花生基因组中克隆了种子贮藏蛋白基因PSC32的启动子AHSSP1,利用半定量RT-PCR检测了PSC32基因表达模式,借助NewPLACE在线分析了AHSSP1序列中存在的顺式作用元件,并构建了AHSSP1驱动GUS报告基因的表达载体,经农杆菌转化获得转基因拟南芥,经GUS组织化学染色鉴定了该启动子的功能。结果表明,PSC32基因957 bp长的启动子AHSSP1序列具备种子特异表达启动子特有的3个RY REPEAT元件。半定量RT-PCR分析发现,PSC32基因在花生成熟种子中表达,而在饱果成熟期根、茎、叶片、花、入土前的果针、成熟种子的果壳中均不表达。GUS组织化学染色发现,转基因拟南芥成熟种子以及萌发种子的子叶、下胚轴和胚根均能够被染上蓝色;长出真叶后,子叶和下胚轴仍能被染色,而根和真叶不能被染上蓝色;成年期转基因拟南芥的叶片也不能被染上蓝色。而野生型拟南芥整个生长时期均不能被染上蓝色。以上现象说明AHSSP1是一个种子特异启动子。本研究丰富了花生种子特异启动子的资源,对花生籽仁品质改良或以花生籽仁作为"生物反应器"的研究具有重...     

花粉管通道法介导的真菌耐盐基因转化拟南芥

橡胶树内生真菌ITBB2-1具有很强的抗盐性,在培养基中添加2倍海水盐度的NaCl能显著促进菌落的生长。采用两种方法研究利用花粉管通道法将ITBB2-1耐盐基因导入拟南芥。多数耐盐转基因植株畸形,生长发育不正常。通过对一千两百余株转基因植株的筛选,获得了耐盐性显著提高、生长发育正常的转基因植株3个。对主要农艺性状统计分析发现,转基因植株叶片的长度、宽度和面积均比野生型植株小,差异达极显著水平。转基因植株SR3的角果长度仅为野生型的64．5％,SR1和SR2的角果长度与野生型无显著差异。本研究表明,在真菌耐盐机制尚未得到研究和耐盐基因尚未克隆的情况下,可以采用花粉管通道法将其耐盐特性导入高等植物中。     

不结球白菜BcLBD37基因的克隆及其对硝酸盐吸收的调节

LBD转录因子是高等植物特有的一类转录因子。为研究不结球白菜LBD基因对硝酸盐吸收的影响,以紫色不结球白菜自交系NJZX3-4为材料,采用同源克隆的方法克隆BcLBD37基因;通过构建PRI101过表达载体,异缘转化拟南芥,实现BcLBD37基因的过表达;同时借助病毒介导的基因沉默技术(VIGS),使不结球白菜中的BcLBD37基因沉默;并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析BcLBD37基因过表达以及沉默后对硝酸盐吸收相关基因表达量的影响。结果表明,该基因片段长度为840 bp,编码279个氨基酸。与野生型相比,转基因拟南芥中硝酸盐代谢相关基因NIA1、NIA2、NRT1.1、NRT1.7、NRT2.1、NRT2.5的表达量均显著下调,硝酸还原酶活性和硝态氮含量亦显著降低。而在不结球白菜中沉默该基因后,沉默植株PTY-2/4中硝酸盐代谢相关基因的表达显著上调,硝酸还原酶活性和硝态氮含量亦显著提高。综上可知,BcLBD37基因通过抑制硝酸盐代谢相关基因的表达,调节硝酸还原酶的活性,进而抑制$\text{NO}_{3}^{-}$的吸收。本研究为提高不结球白菜营养品质提供了理论依据。     

磷脂酶Dβ在拟南芥低温信号中的转导作用

磷脂酶D（PLD）不仅是植物中一类主要的磷脂水解酶,而且是一类重要的跨膜信号转导酶类。PLD的磷脂降解功能和信号转导功能均影响植物的抗冻性。本研究以PLDβ基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型植株为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,并分析其作用途径。结果表明,PLDβ基因介导低温信号转导作用,参与渗透调节途径中脯氨酸的调控和抗氧化系统中过氧化氢酶（CAT）活性的调控,并且与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径。本研究为探索通过调控PLD的活性提高植物抗冻性提供了新的途径,并为深入揭示植物的抗冻机理以及磷脂信号转导机制提供实验支持。     

Improving potassium acquisition and utilisation by crop plants

To avoid loss of yield, crops must maintain tissue potassium (K) concentrations above 5–40 mg K (g DM)^–1. The supply of K from the soil is often insufficient to meet this demand and, in many agricultural systems, K fertilisers are applied to crops. However, K fertilisers are expensive. There is interest, therefore, in reducing applications of K fertilisers either by improving agronomy or developing crop genotypes that use K fertilisers more efficiently. Agronomic K fertiliser use efficiency is determined by the ability of roots to acquire K from the soil, which is referred to as K uptake efficiency (KUpE), and the ability of a plant to utilise the K acquired to produce yield, which is referred to as K utilisation efficiency (KUtE). There is considerable genetic variation between and within crop species in both KUpE and KUtE, and chromosomal loci affecting these characteristics have been identified in Arabidopsis thaliana and several crop species. Plant traits that increase KUpE include (1) exudation of organic compounds that release more non‐exchangeable soil K, (2) high root K uptake capacity, (3) early root vigour, high root‐to‐shoot ratios, and high root length densities, (4) proliferation of roots throughout the soil volume, and (5) high transpiration rates. Plant traits that increase KUtE include (1) effective K redistribution within the plant, (2) tolerance of low tissue K concentrations, and, at low tissue K concentrations, (3) maintenance of optimal K concentrations in metabolically active cellular compartments, (4) replacement of K in its non‐specific roles, (5) redistribution of K from senescent to younger tissues, (6) maintenance of water relations, photosynthesis and canopy cover, and (7) a high harvest index. The development of crop genotypes with these traits will enable K fertiliser applications to be reduced.