思茅松毛虫成虫肠道细菌多样性

【目的】 研究野外采集的思茅松毛虫（Dendrolimu kikuchii）成虫的肠道细菌多样性,为思茅松毛虫的防治和云南松（Pinus yunnanensis）等树木的保护奠定基础。【方法】 分别提取思茅松毛虫雄蛾和雌蛾的肠道总DNA,基于Illumina NovaSeq（PE250）平台运用高通量技术对肠道细菌16S rDNA基因V3~V4区进行测序和分析,分析雄虫和雌虫的肠道菌群的结构多样性。【结果】 从思茅松毛虫成虫中共获得1 278个操作分类单元（OTUs）,涵盖28个门75个纲173个目296个科550个属。在门水平上,雄蛾和雌蛾的优势菌为变形菌门（Proteobacteria,雌81.27%/雄81.17%）;在科水平上,雄蛾的优势菌科是鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae,49.16%）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae,19.09%）,雌蛾的优势菌科是欧文氏菌科（Erwiniaceae,34.09%）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae,16.68%）;在属水平上,雄蛾的优势菌属是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas,48.09%）,雌蛾的优势菌属是泛生菌属（Pantoea,31.58%）。思茅松毛虫雌蛾肠道细菌的物种多样性比雄蛾丰富。雄蛾肠道中丰度差异显著性最高的菌群为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）,雌蛾肠道中丰度差异显著性最高的菌群为γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）。【结论】 思茅松毛虫成虫肠道具有丰富的细菌资源。     

咖啡酸苯乙酯通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解猪精液常温保存氧化应激的作用机制

【目的】探究咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester,CAPE）通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解氧化应激对猪精液的影响及其分子机制。【方法】选取8头成年（1—2岁）、健康状况良好长白种公猪进行鲜精采集,将质检合格的样品混池待用。试验设计如下：首先,在常温基础稀释液中分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g·L^-1浓度的CAPE,将精液样品与各个浓度组依次混合后放置室温平衡,随即转入17 ℃电子恒温冰箱进行常温保存。全自动精子分析仪（CASA）测定1—5 d精子运动学参数（总活率与渐进性活力）,筛选出最佳适宜浓度为0.06 g·L^-1。其次,将0.06 g·L^-1 CAPE与400 μmol·L^-1的H₂O₂建立氧化胁迫模型,在第1、3、5天分别采用CASA测定精子总活率与渐进性活力,荧光探针技术评估质膜完整性与顶体完整性,抗氧化试剂盒检测过氧化氢酶（catalase,CAT）与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,在第5 天利用实时荧光定量 PCR技术测定AMPK/FOXO3a信号通路下游靶向基因（AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT）及凋亡基因BAX的mRNA表达水平,蛋白免疫印记技术测定AMPK、p-AMPK蛋白表达。【结果】（1）浓度筛选试验中,0.06 g·L^-1的CAPE在保存第3 天显著提高精子的总活率并维持至第5天（P<0.05）,不仅如此,精子的渐进性活力在第1 天显著高于其他处理组（P<0.05）。（2）氧化胁迫试验中,H₂O₂处理组的精子质膜完整性、顶体完整性、总活率、渐进性活力、SOD与CAT活性在保存的第5天均极限显著低于空白组与CAPE+H₂O₂混合组（P<0.001）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的总活率、顶体完整性、CAT与SOD活性不存在显著差异（P>0.05）。与CAPE+H₂O₂混合组相比,H₂O₂处理组AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,BAX的表达水平显著升高（P<0.05）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的AMPK、SOD1、CAT与BAX不存在显著差异（P>0.05）。在蛋白表达水平中,CAPE+H₂O₂混合组与H₂O₂组相比,AMPK、p-AMPK 与p-AMPK/AMPK比率显著提升（P <0.05）。【结论】在常温基础稀释液中添加0.06 g·L^-1CAPE可通过促进磷酸化AMPK的表达,诱导AMPK/FOXO3a信号下游抗氧化分子的转录,继而缓解H₂O₂介导的氧化危害对精液品质产生的影响,延长精液的保存时间,但CAPE保护精子氧化损伤更为深入的分子机制仍需作进一步探究。     

飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′的抗体制备及组织定位

【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗（Locusta migratoria）蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含BamH I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21（DE3）表达菌株中,加入IPTG（终浓度0.5 mmol·L^-1）低温（16℃）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得 pET-32a-R1、pET-32a-R2 和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得 R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射dsLmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。     

14-3-3蛋程中的互作靶蛋白鉴定及其对外源激素的响应

【目的】籽粒灌浆对水稻产量及品质的形成至关重要。14-3-3蛋白是一种信号转导调节因子,在植物生长发育中发挥着重要调控作用。本研究通过分析14-3-3蛋白家族在籽粒灌浆过程中的基因表达模式及其互作靶蛋白,从而揭示其在籽粒灌浆过程中的功能。【方法】利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析水稻14-3-3基因家族在籽粒灌浆过程中的表达变化模式,并从中选取GF14b及GF14e进行后续的蛋白功能分析。利用KEGG数据库对GF14b及GF14e蛋白功能motif位点进行分析;构建GST-GF14b及GST-GF14e表达载体,利用亲和层析技术分别钓取籽粒中与GF14b及GF14e互作的靶蛋白,并借助LC-MS/MS对靶蛋白进行鉴定。采用GST pull-down方法验证靶蛋白与GF14b及GF14e间的蛋白互作关系。利用Kinasephos在线程序对靶蛋白的Ser和Thr磷酸化位点进行预测;采用MapMan 3.6.0软件对靶蛋白的功能及参与的代谢过程进行分析。在籽粒灌浆期（花后15 d）,分别喷施25×10^-6mol·L^-1 ABA,10×10^-6mol·L^-1 IAA,100×10^-6mol·L^-1 GA,50×10^-6mol·L^-1 ZR和 2×10^-4mol·L^-1 BR,研究外源激素处理对籽粒灌浆过程中GF14b,GF14e及其互作靶基因表达的影响。【结果】14-3-3家族基因中,除GF14h外,其余7个家族成员在水稻籽粒中均有表达,其中GF14b及GF14e在籽粒灌浆过程中的表达水平较高且变化幅度较大。通过蛋白序列分析发现,GF14b与GF14e间具有3个相同,2个差异的motif功能位点。通过亲和层析试验,在籽粒中共鉴定到59个与GF14b和72个与GF14e互作的靶蛋白,其中有43个靶蛋白与2个成员均有互作,分别有16个和29个靶蛋白与GF14b和GF14e特异结合。随机选取2个靶蛋白进行体外蛋白互作验证,结果表明靶蛋白SUS3与GF14b和GF14e均存在互作关系,而靶蛋白PSA仅与GF14e有相互作用关系,验证了亲和层析结果的准确性。蛋白功能的分析表明,GF14b和GF14e通过与靶蛋白的结合,共同参与了籽粒灌浆过程中蔗糖转化、淀粉合成、糖酵解、TCA循环等碳代谢途径。同时,GF14b及GF14e还具有特异的调控功能,其中GF14b与核酸代谢及物质转运密切相关,而GF14e与C1代谢中的关键蛋白存在互作。此外,大部分靶蛋白均鉴定到具有潜在的Ser和Thr磷酸化位点。外源激素处理下,籽粒中GF14b和GF14e上调表达,而与淀粉合成代谢相关的靶基因（SUS2、 AGPS、AGPL、PPDK2、SBE）大部分呈下调表达的趋势。【结论】14-3-3基因家族成员GF14b和GF14e在水稻籽粒灌浆过程中的表达变化幅度较大,且会响应激素浓度的改变,并通过蛋白互作的形式负调控淀粉合成代谢相关基因的表达,从而对水稻籽粒淀粉的合成起到重要的调控作用。     

快大型黄羽肉种鸡VD3需要量研究

【目的】通过研究饲粮中添加不同水平维生素D₃（VD₃）对快大型黄羽肉种鸡及其子代肉鸡生产性能、胫骨指标与钙磷代谢的影响,确立黄羽肉种鸡VD₃需要量,为黄羽肉种鸡营养需要量的制定提供科学依据。【方法】试验采用单因素随机分组设计,选用720只48周龄快大型岭南黄羽肉种母鸡,根据体重和产蛋率一致原则分为6个处理组,每组6个重复,每重复20只,各处理分别饲喂添加0（对照组）、800、1 600、2 400、3 200、4 000 IU·kg^-1 VD₃的试验饲粮,试验期8周。种鸡饲养试验结束后选取种蛋孵化,子代肉鸡按照种鸡的组别进行分组分栏饲喂（基础饲粮中含1 000 IU·kg^-1VD₃）,试验期63d。【结果】（1）与对照组相比,添加800 IU·kg^-1 VD₃显著提高平均蛋重（P<0.05）;添加1 600与3 200 IU·kg^-1 VD₃显著增加种蛋的蛋壳强度（P<0.05）;添加1 600 IU·kg^-1 VD₃增加蛋壳厚度（P<0.05）;添加4 000 IU·kg^-1 VD₃显著提高种鸡脱脂胫骨比例与骨密度（P<0.05）,添加VD₃可不同程度地提高种鸡胫骨折断力（P>0.05）;添加VD₃可提高种鸡血浆中钙、磷含量,降低AKP活性（P<0.05）。（2）种鸡饲粮添加VD₃对子代肉鸡生长性能指标无显著影响（P>0.05）;但与对照组相比,添加4 000 IU·kg^-1 VD₃显著提高子代鸡胫骨折断力（P<0.05）,添加800、1 600或4 000 IU·kg^-1VD₃显著增加子代肉鸡胫骨密度（P<0.05）,添加1 600—4 000 IU·kg^-1VD₃可不同程度地提高子代鸡脱脂胫骨比例（P>0.05）;添加VD₃提高了子代肉鸡1日龄血浆中钙、磷含量,降低AKP活性（P<0.05）,但对21、63日龄子代肉鸡无显著影响（P>0.05）。【结论】饲粮中添加VD₃显著影响黄羽肉种鸡产蛋性能、种蛋蛋壳品质、肉种鸡及其子代肉鸡胫骨指标与钙磷代谢。综合试验观测与回归模型来估测黄羽肉种鸡VD₃需要量,饲粮添加800 IU·kg^-1 VD₃即可获得最优产蛋性能,1 650—1 828 IU·kg^-1 VD₃获得最优蛋品质,而获得种鸡和子代肉鸡最优胫骨性状均需要较高的种鸡饲粮VD₃水平（4 000 IU·kg^-1）。     

氮肥运筹与硅肥配施对水稻产量和品质的影响

为提高9108和皖垦糯2号生产区机插水稻生产效率,实现其优质与高产协调发展,用田间试验,分析氮肥运筹与硅肥配施对南粳9108和皖垦糯2号产量和品质的影响。结果表明,以40%基肥、30%分蘖肥和30%穗肥的氮肥运筹配施硅肥450 kg/hm_²为最佳,且与常规氮肥运筹相比,显著提高了每穗总粒数、结实率、整精米率。     

利用多时序激光点云数据提取棉花表型参数方法

当前,能够实现作物表型参数高效、准确的测量和作物生育期表型参数的动态量化研究是表型研究和育种中亟待解决的问题之一。本研究以棉花为研究对象,采用三维激光扫描LiDAR技术获取棉花植株的多时序点云数据,针对棉花植株主干的几何特性,利用随机抽样一致算法（RANSAC）结合直线模型完成主干提取,并对剩余的点云进行区域增长聚类,实现各叶片的分割;在此基础上,完成植株体积、株高、叶长、叶宽等性状参数的估计。针对多时序棉花激光点云数据,采用匈牙利算法完成相邻时序作物点云数据的对齐、叶片器官对应关系的建立。同时,对各植株表型参数动态变化过程进行了量化。本研究针对3株棉花的4个生长点的点云数据,分别完成了主干提取、叶片分割,以及表型参数测量和动态量化。试验结果表明,本研究所采用的主干提取及叶片分割方法能够实现棉花的枝干和叶片分割。提取的株高、叶长、叶宽等表型参数与人工测量值的决定系数均趋近于1.0;同时,本研究实现了棉花表型参数的动态量化过程,为三维表型技术的实现提供了一种有效的方法。     

TaSPX3基因VIGS沉默表达降低小麦对叶锈病(Puccinia recondite f. sp. tritici)的抗性

为挖掘TaSPX3基因在小麦抗叶锈病中的作用,本研究以前期对叶锈菌感染的小麦转录组数据分析发现的TaSPX3基因受到叶锈菌侵染诱导表达为依据,利用BSMV-VIGS系统沉默中国春和郑麦9023中的TaSPX3基因,利用qRT-PCR技术进一步分析小麦抗病相关基因的转录水平。结果发现TaSPX3基因沉默后,小麦叶锈菌感染加重,降低了小麦对叶锈病的抗性;同时,对侵染过程抗病相关基因转录检测发现,抗病相关基因PR2和CAT的表达水平显著下调。本研究表明TaSPX3基因可能通过调控PR2和CAT基因的表达参与小麦对叶锈病的抗性。     

Hormonal changes during meiotic maturation and ovulation in the brook trout (Salvelinus fontinalis)

The plasma levels of estradiol-17 (E2), 17, 20-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20-P) and gonadotropin (GTH) were measured in brook trout (Salvelinus fontinalis) during the period from the end of vitellogenesis to postovulation. Blood samples were taken according to specific stages of maturation, including germinal vesicle breakdown (GVBD) and ovulation. E2 levels were quite high (45 ng/ml) at the end of vitellogenesis (and prior to GVBD) and dropped precipitously by GVBD (2 ng/ml). They remained low through ovulation and postovulation. 17,20-P levels were low prior to GVBD (0.7 ng/ml) and increased dramatically at GVBD (148 ng/ml). The levels of 17,20-P remained high at ovulation (142 ng/ml) and then dropped significantly within 24 h to approximately half of the ovulatory values. They decreased even further by 7 days postovulation. GTH levels rose gradually through GVBD and ovulation from a postvitellogenic level of approximately 3 ng/ml to a 7 day postovulatory value of approximately 10 ng/ml. The overall results; 1) decrease in estradiol prior to GVBD, 2) increase in 17,20-P at GVBD and 3) gradual GTH rise through GVBD and ovulation, are similar to those reported for other salmonids.     

肉鸭3～7周龄预混料及全价饲料优化配方研究

本研究在“肉鸭3～7周龄基础日粮优化配方研究”的基础上，将筛选出的肉鸭3～7周龄2套基础日粮优化配方与3套不同类型的预混料配方进行组合，进行饲养试验与屠宰测定，观察肉鸭的生长速度、饲料报酬、成活率、单位增重饲料成本、屠体品质等性状。结果显示：本试验设计的预混料配方Ⅲ是肉鸭3～7周龄预混料优化配方，优化基础配方Ⅰ与预混料配方Ⅲ、Ⅱ的组合均为肉鸭3～7周龄全价饲料优化配方。