贵州黑山羊COL1A1基因真核表达载体构建及其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔基因的影响

【目的】构建I型胶原蛋白α1链基因（COL1A1）过表达载体,并分析其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔相关基因的影响,为后续深入研究COL1A1基因影响山羊产羔性状的分子机制打下基础。【方法】通过重叠延伸PCR克隆COL1A1基因A和B片段,然后分别重组连接至pUC57和pcDNA3.1（+）线性化载体上,再通过酶切连接获得COL1A1基因全长,构建pcDNA3.1(+)-COL1A1过表达载体;转染山羊卵巢颗粒细胞后,通过Western blotting检测COL1A1蛋白表达效率,采用免疫荧光检测其在颗粒细胞中的定位情况,并以实时荧光定量PCR检测COL1A1基因过表达对胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔相关基因[骨形态发生蛋白15(BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR1B)、生长分化因子9(GDF9)和促卵泡激素β亚基（FSHB）]表达的影响。【结果】COL1A1基因全长环化质粒检测大小为1847 bp,连接至pcDNA3.1（+）线性化载体上成功构建获得COL1A1基因过表达载体。Western blotting检测结果表明,pcDNA3...     

耐盐水稻长毛谷的生理测定及其全基因组测序分析

【目的】探讨耐盐水稻长毛谷的苗期耐盐性,并对其全基因组测序数据进行分析,以期阐明长毛谷的耐盐生理机制,为挖掘优质耐盐水稻品种及改良盐碱地提供参考。【方法】以Pokkali(耐盐对照)、IR29(盐敏感对照)及前期筛选出的耐盐水稻长毛谷为试验材料,设5种盐浓度(0、80、100、120和150 mmol/L)处理,测定3份水稻材料苗期的9项表型指标和13项生理指标,并基于全基因组测序数据探讨长毛谷的耐盐生理机制。【结果】盐胁迫下长毛谷的各项表型指标受盐浓度变化的影响最小,抗氧化酶活性更强,其他活性物质、渗透调节物质含量更高,盐胁迫对其造成的细胞膜损伤更小,对盐胁迫具有较好的耐受性。相关分析结果显示,长毛谷幼苗的生物量积累与苗高、根长、根尖数、根表面积和根体积呈极显著正相关(P<0.01,下同),与丙二醛(MDA)和过氧化氢(H₂O₂)含量呈极显著负相关,且超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性及可溶性蛋白和谷胱甘肽(GSH)含量6个生理指标间两两呈极显著正相关。通过将30个已...     

2022—2023年我国部分地区猪A群轮状病毒分子流行病学调查分析

【目的】探究我国部分地区猪A群轮状病毒（RVA）的分子流行病学特征,明确当前的优势基因型,为RVA科学防控与疫苗研发提供理论依据。【方法】2022年1月—2023年3月收集江苏、江西、福建、山西和贵州5省36个规模化猪场送检的434份腹泻仔猪粪便样品,采用RT-PCR检测样品RVA阳性情况,对部分RVA阳性样品的VP7和VP4基因进行扩增及测序,与各型参考序列进行多序列比对,使用MegAlign进行核苷酸序列同源比对分析,并采用MEGA 7.0的邻接法构建系统发育进化树。【结果】RT-PCR检测结果显示,434份腹泻仔猪粪便样品中RVA阳性样品为196份,阳性检出率为45.16%。2022年与2023年初的阳性检出率分别为40.37%(132/327)和59.81%(64/107)。根据样品来源地区,RVA阳性检出率最高的是江苏（57.70%）,其次是江西（55.71%）,福建、贵州和山西的RVA阳性检出率分别是35.66%、30.00%和22.23%。共获得各地区12株RVA的VP4和VP7基因序列信息,遗传进化分析结果表明,G型中G9为优势基因型（占83.4%）,G4和G5分别占8...     

鼠源eIF4A1基因克隆及其原核/真核表达鉴定

【目的】克隆昆明小鼠真核生物翻译起始因子4A1基因（eIF4A1）并构建其原核/真核表达载体,探究其结构和生物学特性,为在体内外鉴定e IF4A1互作蛋白网络打下基础。【方法】以昆明小鼠脑组织总RNA反转录合成的cDNA为模板,PCR扩增鼠源e IF4A1基因编码区（CDS）序列,然后克隆到pGEX-4T-1和pcDNA3.0载体上分别构建原核/真核表达载体;利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞对原核表达载体进行诱导表达、纯化及鉴定;同时以真核表达载体转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞内的表达及分布情况;并以ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对鼠源eIF4A1蛋白进行生物学信息分析。【结果】鼠源eIF4A1基因CDS序列长1221 bp,克隆到pGEX-4T-1载体能成功构建原核表达载体pGEX-4T-eIF4A1-Flag,在25和30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导均能大量表达出融合蛋...     

黔北麻羊SIRT1基因睾丸组织表达及其过表达对间质细胞发育和抗氧化能力的影响

【目的】分析沉默信息调节因子1(SIRT1)在黔北麻羊不同月龄睾丸组织与12月龄性腺轴组织中的表达水平,以及对睾丸间质细胞发育及抗氧化能力的影响,为探明SIRT1基因调控睾丸间质细胞生长发育机制提供理论基础。【方法】以1、3、6、9和12月龄健康的黔北麻羊公羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR检测不同月龄睾丸组织及12月龄性腺轴组织（下丘脑、垂体、睾丸和附睾）中SIRT1的表达量;将过表达载体pEGFP-N3-SIRT1和空载体pEGFP-N3转染至山羊睾丸间质细胞,运用CCK-8法检测细胞的增殖情况,划痕试验检测细胞迁移效率,利用实时荧光定量PCR检测细胞增殖、发育及抗氧化相关基因的表达量。【结果】SIRT1基因在3、6、9和12月龄睾丸组织中的表达水平均显著高于1月龄（P<0.05,下同）,以12月龄的相对表达量最高;在性腺轴上,睾丸组织中SIRT1基因相对表达量显著高于下丘脑、垂体和附睾。CCK-8法结果显示,过表达SIRT1基因在12 h后极显著促进睾丸间质细胞的增殖（P<0.01）;划痕试验发现,过表达SIRT1基因组在9和18 h的细胞迁移率均显著高于空载体组;...     

小麦响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因筛选与鉴定

【目的】筛选鉴定小麦品种连麦12响应禾谷镰刀菌侵染过程中的核心基因,为小麦赤霉病防御分子网络提供理论参考。【方法】对成功感染禾谷镰刀菌的连麦12小穗进行转录组测序,通过DESeq筛选差异表达基因（DEGs）,对DEGs进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,构建DEGs的蛋白质互作网络,通过MCODE和cytoHubba筛选核心基因。【结果】对小麦品种连麦12接种禾谷镰刀菌（处理组）和接种无菌去离子水（对照,CK）72 h后的DEGs进行筛选,结果共筛选出14180个DEGs,其中有10966个DEGs上调表达,有3214个DEGs下调表达。经GO功能注释分成三大类,共51个条目,其中,细胞组分包含14个条目,主要富集在细胞、细胞部件和膜3个条目;分子功能包含11个条目,主要富集在催化活性和结合2个条目;生物学过程包含26个条目,主要富集在细胞过程、代谢过程和刺激反应3个条目。KEGG信号通路富集分析结果显示,富集到代谢、次级代谢物生物合成、苯丙烷类生物合成、植物信号激素转导、植物MAPK信号通路的DEGs数量最多;富集到光合作用—天线蛋白通路,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,谷...     

陆川猪ACOX1基因不同亚型克隆及其表达差异分析

【目的】克隆陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1(Acyl-CoA oxidase 1,ACOX1)基因不同亚型,进行生物信息学分析,并分析ACOX1基因及其亚型在不同品种猪背最长肌中的表达情况,为研究ACOX1基因在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据。【方法】根据GenBank中ACOX1基因序列（NM＿001101028.1）及所克隆获得陆川猪ACOX1基因编码区（CDS）序列,设计特异性扩增和验证引物,采用TRIzol法提取0月龄陆川猪肝脏及8月龄陆川猪、杜洛克猪、杜陆猪和陆杜猪背最长肌的总RNA,反转录合成cDNA,以0月龄陆川猪肝脏cDNA为模板进行克隆和验证,获得陆川猪ACOX1基因不同亚型序列,并利用在线工具进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测ACOX1基因不同亚型在背最长肌组织中的表达情况。【结果】陆川猪ACOX1基因存在2种亚型结构（ACOX1-Ⅰ和ACOX1-Ⅱ）,NCBI登录号分别为OQ701687和OQ701688;2种亚型CDS长度均为1986 bp,共编码661个氨基酸残基,2种异构体主要是第270～429位氨基酸进行选择性剪切,陆川猪ACOX1-Ⅰ型编码蛋白...     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在成鱼组织和不同发育时期胚胎中的表达分析

抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。     

弓形虫SAGⅠ基因的克隆与原核表达

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有免疫反应活性。为进一步进行弓形虫病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。     

编码杜果丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增‘紫花芒’杧果嫩绿色叶片基因组DNA。在NCBI中用Blast X比对发现,有6个阳性克隆是抗病基因同源序列,并命名为PK1～PK6,GenBank注册序列号为AY693369-AY693371和AY776277-AY776279。在PK3、PK4和PK6中发现了丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的9个催化结构域Ⅰ～Ⅸ,而其它3个克隆具有部分结构域。氨基酸序列同源性分析还发现,6个克隆编码的氨基酸序列都与受体样蛋白激酶有较高的氨基酸序列同源性。系统进化树分析还表明它们都是可能的抗病基因同源序列。总之,6个克隆不仅是抗病基因同源序列而且是可能的受体样蛋白激酶基因同源序列。