飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的特性及生物学功能

【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶（glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA）的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1 天至第7 天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a（+）蛋白表达载体,在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋白的酶学活性;通过RNA干扰研究GNA的生物学功能。【结果】飞蝗GNA与其它物种GNA的氨基酸序列一致性很高,结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致,说明不同物种间GNA非常保守;飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明,GNA在刚蜕皮后的表达量最高,之后逐步降低;飞蝗GNA重组蛋白在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株中成功表达,经过Ni-NTA柱纯化得到单一目的条带,酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37-50℃,最适pH为8.0-9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值,当D-GlcN6P的浓度为200 μmol•L-1时,Acetyl-CoA的Km=133.60 μmol•L-1;当Acetyl-CoA的浓度为200 μmol•L-1时,D-GlcN6P的Km=42.43 μmol•L-1;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示,GNA的表达能够被有效沉默,但蜕皮及发育未受影响。【结论】飞蝗GNA与其它物种的GNA氨基酸序列一致性很高;用该序列原核表达的重组蛋白具有葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性;飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响,推测存在N-乙酰葡萄糖胺激酶（GlcNAc kinase）补救途径催化产生GNA的底物N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc6P）,用于几丁质的合成。     

5-氨基乙酰丙酸在动物铁代谢调控中的应用进展

随着动物饲养环境的变化和生产水平的提高,铁元素营养的重要性逐渐提高,铁代谢调控成为近年来关注点之一。本研究对动物生产中的铁营养现状、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)对铁代谢调控的机理及在动物饲料中的应用进展进行了综述。ALA的合成是动物体内生成血红素的限速反应。日粮补充ALA能增加血红素合成量,提高机体对铁元素的利用效率。这为动物铁代谢调控提供了一个新途径。     

棉花线粒体atp9基因的克隆和转录研究

以三系杂交棉胞质雄性不育系P30A、保持系P30B和恢复系Y18为材料,通过Tail-PCR从可育胞质获得线粒体atp9基因序列,并利用Northern blot分析了atp9基因在棉花幼蕾的的转录情况。结果显示:在三系中atp9基因均存一个0.5 kb的强杂交带和一个1.0 kb的弱杂交带,杂交结果无明显差异;三系中atp9基因编码区共有7个编辑位点,第7个编辑位点密码子由于编辑转变为终止密码子使翻译提前终止;atp9基因在保持系中幼蕾的编辑频率要明显低于不育系和恢复系;发现atp9基因的编辑与棉花胞质形式相关,而且不同的核背景也会影响编辑率,推测线粒体atp9基因与棉花的胞质雄性不育具有一定的相关性,但有待更进一步分析。     

反义托品酮还原酶Ⅱ基因对三分三的遗传转化及生物碱含量测定

[目的]通过反义托品酮还原酶Ⅱ基因提高托品酮还原酶I（TRI）的表达水平,从而增加莨菪碱在三分三中的含量,为大规模开发生产托品烷生物碱提供理论基础。[方法]将携带反义托品酮还原酶Ⅱ基因的重组工程菌C58C1-p1304＋-antTRⅡ采用叶盘法对三分三进行遗传转化。潮霉素筛选转基因发根,PCR检测转基因发根基因组中是否同时含有rolB、rolC和Hygr抗性基因。PCR阳性转基因发根扩大培养后,提取生物碱,并采用高效液相色谱法进行生物碱含量测定。[结果]共有9个转基因发根的基因组同时检测到rolB、rolC和Hygr抗性基因,且这9个转基因发根中的莨菪碱含量较对照有不同程度的提高。[结论]反义托品酮还原酶II基因对托品烷生物碱代谢途径起到一定程度的正调控作用。     

反义寡核苷酸介导的miRNA沉默研究

miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,长度约为22个核苷酸,参与多种生理过程及多种疾病的发生、发展过程。miRNA沉默技术是研究miRNA生物学功能的重要工具,也为以miRNA为靶点的疾病诊断和治疗提供可能。多种化学修饰的反义寡核苷酸和相应的提呈系统被用于miRNA的研究。     

豚鼠牙齿组织总RNA的提取研究

[目的]研究对RNA丰度值低、硬度大、处理困难的牙齿组织总RNA的提取和纯化技术。[方法]采集10只Hartley豚鼠的切齿和臼齿,分别对其进行了总RNA的提取和纯化,对所提纯的总RNA进行了琼脂糖凝胶电泳鉴定,以及浓度和纯度的测定。[结果]切齿和臼齿总RNA均可见明显的28S、18S和5S三条带,RNA浓度均大于100 ng/μl,A260/A280值均在1.7～2.0之间,A260/A230值在0.1～0.7之间,总RNA的提纯效果较好。[结论]为动物硬组织总RNA的提取提供了技术参考。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

动物转基因新技术研究进展

 动物转基因技术是将外源基因导入动物体内,外源基因随机整合或定点整合（打靶）在染色体基因组上并得到表达和遗传的生物技术。该技术自发现以来,在畜牧业、医药产业、环境保护以及新型生物材料等领域已得到了广泛应用。本文主要就近年来迅速发展起来的慢病毒载体导入法、精原干细胞法、锌指核酸酶介导的基因打靶、RNA干扰介导的基因沉默等新的高效转基因技术进行了概述。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS功能分析

[目的]利用RNA干扰技术探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS的功能.[方法]将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSi lent-1载体中,构建StPKS的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2.利用聚乙二醇(PEG)介导的方法将之转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,通过潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子中StPKS的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异.[结果]本研究构建了StPKS RNA干扰载体并进行了成功转化,经潮霉素抗性筛选和PCR验证最终获得了9个阳性转化子,其中5个转化子菌落颜色变浅.对转化子进行半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS表达量均有所下降;黑色素产量显著降低;菌丝呈不规则状,发生了膨大、变形、分枝等现象.[结论]StPES在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生.     

核桃子叶RNA提取方法的研究

针对核桃子叶富含酚类、色素、多糖、油脂等物质的特点,以常用的Trizol法、异硫氰酸胍法、SDS法和改良的CTAB法4种方法提取核桃子叶总RNA,通过RNA产率、纯度、电泳图谱来确定适于核桃子叶RNA提取的方法。结果表明：Trizol法和SDS法所提取的RNA纯度较低;异硫氰酸胍法所提取的RNA降解严重,RNA以小分子...