利用DAD1反义片段转化创建菜薹可调控雄性不育材料

 菜薹因为没有好的雄性不育材料或自交不亲和系,至今尚无一代杂种用于生产,根据拟南芥及白菜型油菜的花药不开裂基因DAD1的保守序列设计引物,扩增菜薹的DAD1基因片段（DAD1F）,构建反义DAD1F植物表达载体,用农杆菌介导法转化菜薹,对转基因植株进行分子检测,鉴定其雄性不育性并进行育性恢复试验.克隆得到的菜薹的DAD1基因片段大小为678 bp,命名为BrcpDAD1F,其序列与拟南芥和白菜型油菜的DAD1高度同源,同源率分别为88％和99％;共得到了12株转基因植株,有6株在转录水平上得到表达,表现为雄性不育,花器官畸形,花粉活力低,萌发率不到10％,且开花后不能结角果或结空角果,或者得到极少种子但种子不萌发;用对照的花粉给转基因植株授粉可使其正常结实.以500 μmol·L^-1茉莉酸甲酯处理可使其雄性不育得到恢复,花粉可以在柱头和培养基上萌发,具有受精能力。T₁代可育株与不育株的比例都呈1:3分离, T₂代不同株系的育性分离比例不同,有些株系继续呈1:3的分离,有些株系全是可育株或全是不育株,说明反义抑制呈单基因稳定遗传。     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA, 是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验。在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下, 取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤, 并达到研究相关基因表达的目的。本研究利用TR izo l法提取RNA, 获得的各样品RNA条带完整、纯度高。结果表明, 4 种保护性组织提取的RNA 经过逆转录反应, 得到了高质量的CDNA。内标基因( B- actin)、热激蛋白基因( hsp70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带, 通过NCB I数据上的BLAST比对证明, 各序列的同源性在95%以上。利用本研究的方法, 可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性, 用于进一步的分子生物学研究。     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。     

寄主诱导的基因沉默提高植物真菌病害抗性研究进展

寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)以病原菌生长发育、产孢繁殖、侵染或致病过程中的关键基因作为靶点,在寄主植物中表达针对靶基因的RNAi构建体,在病原菌侵染植物的过程中,摄入相应的ds RNA或si RNA分子,通过识别、结合特异核苷酸序列,干扰病菌靶基因表达,从而抑制病菌侵染和扩展,使植物表现抗病。这项技术为培育基于病原菌特异序列的植物抗病性奠定了基础,显示了巨大的应用潜力。本文综述了利用HIGS技术提高植物真菌病抗性的最新研究进展,总结了国内外利用这项技术改良植物真菌病害抗性的主要策略、技术路线,展望了发展应用前景。     

棉铃虫膨胀线粒体基因组的鉴定与分析

以已公布的棉铃虫线粒体DNA序列对来自4头棉铃虫雄蛹的DNA的三代测序数据进行筛选,获得了11条与线粒体DNA有同源性的三代read序列,并根据其中的read 66003鉴定出了一种膨胀的线粒体基因组。该线粒体基因组大小为27 113 bp,其保守区域包含13个蛋白编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因以及1个AT富集区,与已公布的棉铃虫线粒体基因组的结构相似。膨胀区域位于cox1基因编码区内部,大小为11 467 bp,经预测含有一个完整的真核基因(依赖ATP的RNA解旋酶)以及多种转座元件的片段,但与线粒体DNA无同源性,也无I类或Ⅱ类内含子存在的证据。对田间和室内棉铃虫DNA样品的PCR扩增未能检测到膨胀线粒体基因组的存在。以上结果表明膨胀片段可能是细胞核DNA序列通过偶然的水平转移事件而整合到线粒体基因组中的,且该种膨胀方式的发生概率极低。本文报道的膨胀线粒体基因组为日后动物线粒体基因组学的研究提示了一种独特的变异方式。     

绵羊精子RNA提取方案的优化

为了减少绵羊精液中其他体细胞污染和裂解不充分等因素而导致精子RNA回收率低、质量差的问题,试验以新鲜的美利奴羊精液为研究对象,采用Percoll+hSOF和Percoll+PBS密度梯度离心法和PBS直接洗涤法纯化绵羊精液,然后再采用TRIzol(65℃)法和TRIzol(65℃)+试剂盒法提取绵羊精子RNA,检测RNA的浓度、纯度和完整性,将RNA反转录为cDNA,PCR扩增PRM1基因(编码鱼精蛋白1)和CDH1基因(编码上皮细胞钙黏蛋白),验证所提取的RNA是否受体细胞RNA和基因组污染。结果表明：用Percoll密度梯度法纯化绵羊精液较PBS直接洗涤法能更好地去除精液中的体细胞,但精子回收率低。Percoll+PBS密度梯度离心法纯化后精子提取的RNA较PBS直接洗涤法纯度较高,但浓度较低;TRIzol(65℃)法提取的精子RNA较TRIzol(65℃)+试剂盒法浓度较高,但纯度较低。两种精液纯化方法(Percoll+PBS密度梯度离心法和PBS直接洗涤法)结合两种精子RNA提取方法[TRIzol(65℃)法和TRIzol(65℃)+试剂盒法]获得的精子RNA均能检测到PRM1...     

"自杀性"DNA疫苗研究进展

DNA疫苗作为第三代全新的疫苗,具有传统疫苗和其他基因工程苗不可比拟的优点.但由于其安全性方面存在着一些尚待解决的问题,使得实际应用受到限制."自杀性"DNA疫苗是基于常规的DNA疫苗和自主复制型RNA疫苗而发展起来的一种新型疫苗.由于其制备原理和过程与常规DNA疫苗相类似,所以它具备常规DNA疫苗在制作、运输储存以及免疫等各方面的优点.同时由于它以甲病毒复制子为基础能诱导转染细胞自主凋亡,故比常规DNA疫苗更为安全有效.文章针对"自杀性"DNA疫苗载体的构建、作用机理、优点以及国内外研究情况作一介绍.     

耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans中非编码RNA

耐辐射奇球菌(Deinococcus Radiodurans)对电离辐射、紫外线以及强氧化剂等方面具有惊人的抗性。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在参与转录调控、RNA的加工与修饰、mRNA的转录、蛋白质的运输与稳定性调节等方面具有非常明显的作用。本文通过概率上下文无关算法(Stochastic ContextFree Grammar,SCFG),对耐辐射奇球菌R1菌株的基因间序列进行相似二级结构预测,结果发现,在耐辐射奇球菌R1基因组的非编码区存在28个非编码RNA家族。其中IRE家族成员最多,其次是Histone3、tRNA和SECIS家族。所发现的DicF与ctRNA_pGA1t、mRNA等家族成员为细菌所特有。与其他生物比较分析结果显示,可以用这些非编码RNA来研究耐辐射奇球菌的生物学功能,并为进一步研究其DNA损伤与修复分子机制提供依据。     

葡萄银染mRNA差异显示分析体系的建立及优化

mRNA差异显示(mRNA differential display)技术是筛选差异表达基因有效的方法之一（Peng and Agthui,1992)。本研究以中国葡萄属野生种的葡萄叶片为材料,采用改进的SDS／酚法(张今今等,2003)提取叶片总RNA,采用优化后的银染差显体系,比较葡萄白粉病病原菌诱导前后6个不同时期的样品,获得了数量适宜、差异显著和重复性好的差异表达cDNA片段。     

PCR法构建小鼠α-1,3-GT基因沉默载体研究

在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列,针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,然后把该序列克隆到pGEM-T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础.