日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

缢蛏2-CRD型半乳糖凝集素(Galectin)基因的克隆和表达分析

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了缢蛏半乳糖凝集素基因(ScGL)。ScGL全长为1 282 bp,5′非编码区35 bp,3′非编码区329 bp,开放阅读框(ORF) 918 bp,编码305个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScGL无跨膜结构域,与已报道的缢蛏半乳糖凝集素含1个糖识别结构域(CRD)不同,ScGL具有2个CRD。相似性分析显示,ScGL与其他软体动物的半乳糖凝集素具有较高的相似性,与菲律宾蛤仔相似性最高,达65%;与已报道的2个缢蛏半乳糖凝集素相似性分别为39.74%和44.76%。系统进化上ScGL与菲律宾蛤仔半乳糖凝集素聚为一支。重组表达发现ScGL在包涵体表达,分子量约34.4 ku。荧光定量PCR分析显示,ScGL在缢蛏鳃、肠、唇瓣、外套膜、出水管、入水管、足和内脏团中均表达;其中肠、内脏团、唇瓣和足中表达量较高,出水管和入水管中表达量最低。消化腺ScGL表达量分别在金黄色葡萄球菌感染后3 h和48 h显著高于对照组;鳃ScGL表达量分别在鳗弧菌和金黄色葡萄球菌感染后6 h和48 h显著高于对照组,说明ScGL参与了病原体诱导的缢蛏免疫应答。本研究为深入探索ScGL在缢蛏免疫中的作用奠定基础。     

凝集素的作用与应用

凝集素是一类具有糖专一性、可使细胞凝集的糖蛋白。它能与糖专一性、非共价可逆结合,广泛存在于植物、动物等生物细胞膜上、细胞质内和细胞外基质中。由于凝集素的存在比较广泛,且具有专一性的识别能力,具有促使细胞凝集、细胞有丝分裂、防御昆虫危害、消除入侵的微生物等外源     

刺参凝集素的分离纯化及其性质

为探寻刺参药用价值,探索其抑制肿瘤细胞增殖,促进淋巴细胞转化等生物功能。将刺参(Apotichopusjaponicus)经磷酸盐缓冲溶液抽提,20%~75%硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-200分子筛层析,得到刺参凝集素(AJL)。用Sephadex G-200分子筛层析测得其分子量为85 652Da。AJL的含糖量为20.9%。该凝集素可以凝集人的A、B、AB、O型红细胞,且对A型红细胞凝集作用最强,在对兔、鼠、鲤鱼、鸡和人的A、B、AB、O红细胞的凝集作用中,对鸡的凝集作用最强。该凝集素凝集兔红细胞的作用不被D-果糖、D-甘露糖、γ-球蛋白、葡萄糖、蔗糖、甘露聚糖所抑制,而被牛甲状腺球蛋白所抑制,其最小抑制浓度为1.55mg.mL-1。该凝集素凝集兔红细胞的作用不被二价金属离子Ca2 、Mg2 及EDTA所抑制。该凝集素在pH4.0~10.14系列缓冲液中均有活性,其中在pH4.4~7.5范围内血凝活性最高。该凝集活性在90℃加热30min后仍然对红细胞有凝集活性,显示出较高的热稳定性。     

抗病虫基因新资源:海洋绿藻孔石莼凝集素基因

植物凝集素(Lecin)具有抵抗植物病原菌和农业害虫的活性以及抗病毒活性,在植物保护上具有广阔的应用前景。从海洋绿藻孔石莼中分离到一种凝集素基因序列,为培育抗病虫作物新品种提供了新资源。     

肝脏中清除炎症细胞的“功臣”现身

由军事医学科学院院长、中国科学院院士贺福初领导的蛋白质组学国家重点实验室,在肝脏中发现了一种重要的免疫调控蛋白LSECtin（肝窦内皮细胞C型凝集素）。     

17种真菌凝集素的凝血活性研究

通过Tris-HCl、Na2HPO4-NaH2PO4两种缓冲液,从17种供试大型真菌中粗提凝集素,以3％兔红细胞对所得34种提取物进行凝血检测,结果表明,绝大多数真菌提取液具有凝血活性,其凝血效价最高的为经Tris-HCl缓冲液提取的斑褐孔菌及经Na2HPO4-NaH2PO4提取的蛹虫草、灰平菇。     

不同地区马铃薯凝集素含量与活性的测定分析

植物凝集素是一个超级蛋白质家族,能凝集细胞.不同植物凝集素含量和活性均不相同,即使同一品种植物由于所生长的地区环境不同,其含量和活性也各不相同.本试验对两个不同地区的白瓤马铃薯就此两方面进行了初步研究.结果发现.东北马铃薯的凝集素含量和活性远大于山东马铃薯.     

不同马铃薯品种凝集素含量和活性比较

植物凝集素是一类具有高度特异性的糖结合活性的蛋白,能凝集细胞.不同植物凝集素含量和活性均不相同,即使同一种植物由于品种不同,其含量和活性也各不相同,就此两方面,试验首先通过葡聚糖凝胶层析法和分光光度法得出黄瓤马铃薯凝集素含量多于白瓤马铃薯,继而通过血凝平板试验得出同等条件下黄瓤马铃薯凝集素活性也大于白瓤的.表明,黄瓤马铃薯凝集素含量和活性均大于白瓤马铃薯.     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.