黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础.     

阔叶猕猴桃果实GalDH cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以猕猴桃属植物中果实维生素C含量最高的阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia Merr. ) 果实为试 材, 经RT2PCR扩增获得约110 kb的L - 半乳糖脱氢酶cDNA片段。生物信息学分析表明, 该cDNA片段长为997 bp, 最大开放阅读框为960 bp, 可编码319 个氨基酸残基, 命名为A lGalDH, GenBank登录号为EU525846, 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物GalDH核苷酸、氨基酸序列间的同源性分别在76%和70%以上, 且具有醛酮还原酶的保守结构域。构建了其原核表达载体pET-A lGalDH并转化大肠杆菌BL21, 经0.1 mmol·L ^{- 1} IPTG诱导, 获得具有较高活性的表达融合蛋白6 ×His-AlGalDH。经Ni-His亲和磁珠分离纯化, 获得单一的融合目的蛋白条带, 测定其酶活为120 pmol·min^{- 1} ·mg^{- 1}。     

白菜亚硝酸还原酶基因BcNiR的克隆及表达分析

 以白菜品种‘苏州青’自交系叶片cDNA为模板, 采用RT-PCR、3′RACE和5′RACE技术, 获得了编码亚硝酸还原酶基因(NiR) 的cDNA全序列1 852 bp, 包含有1 749 bp的开放阅读框, 编码583个氨基酸, 命名为BcNiR。所推导的氨基酸序列与拟南芥NiR1、烟草nii2编码的氨基酸序列具有较高同源性, 分别为83%和76%。生物信息学分析表明, BcNiR具有完整的NiR蛋白结构, 含血红素蛋白β - 化合物区域, 一个明显的西罗血红素siroheme结合位点和4Fe-4S区域, 可以在SWiSS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构。RT-PCR结果显示, 该基因在叶片中的表达量远远高于根系, 在以0、10、20、30、40 mmol·L ^{- 1}硝态氮各分别处理0、2、4、6、8、12 h的试验中, 30 mmol·L ^-1处理4 h可使BcNiR的表达量达到最大; 5和10 mmol·L ^{- 1}铵态氮处理试验表明, 高浓度的铵抑制该基因的表达。     

嗜水气单胞菌UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶基因的克隆表达及酶的性质

通过水生动物源性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）强毒株J-1株与弱毒株MR-1株抑制差减杂交得到gneJ差减片段,该片段与创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和人源嗜水气单胞菌的UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶基因有较高的同源性。扩增完整的gneJ基因,进行分布检测并将其克隆至质粒pET32a（＋）,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中进行异源表达,SDS-PAGE结果显示,重组表达蛋白的分子量约59．7kD,与理论推测值基本相同。酶活性分析表明,该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺,确证gneJ基因编码蛋白为UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶。Western Blot分析显示,嗜水气单胞菌J-1株胞外产物的兔抗血清可识别该重组蛋白,表明该蛋白与天然蛋白有相同的抗原性。以重组蛋白为免疫原,对小鼠进行动物保护实验,结果显示,该重组蛋白对小鼠有60％的保护率,证明UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶可作为亚单位疫苗的侯选成分。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

野生番茄LA2157中热稳定抗根结线虫基因Mi-9候选基因的分离与过表达载体构建

根结线虫是番茄上的重要土传病害,选育抗根结线虫品种是最有效的防治方法,但是目前转育到栽培番茄中的抗根结线虫基因Mi-1在土温高于28℃时就丧失了抗性。本试验利用热稳定抗根结线虫野生番茄材料LA2157,根据Mi-1基因的序列信息,对其中热稳定抗根结线虫Mi-9基因进行同源克隆,在LA2157中共获得2个候选基因片段;通过In-Fusion克隆技术,将候选基因与过表达载体p BI121进行连接,经电泳检测和测序分析,最终构建Mi-9候选基因的过表达重组载体。     

月季bHLH基因的克隆、表达及其与MYB和WD40的互作分析

以月季‘月月红’(Rosa chinensis‘Slater’s Crimson China’)花瓣为材料,利用同源克隆法鉴定到1个Rcb HLH基因的c DNA全长序列,并研究了其生物信息学特征、组织特异性表达及其与MYB和WD40的互作关系。序列分析表明,Rcb HLH的开放阅读框长2 112 bp,编码703个氨基酸,基因登录号为KY783912。结构域序列分析显示,Rcb HLH为一个保守的N端含有碱性氨基酸的DNA结合区、C端含有α螺旋–环–α螺旋的b HLH蛋白。对Rcb HLH进行系统进化分析发现,Rcb HLH与草莓及其他蔷薇科植物的b HLH蛋白具有较高的同源性。组织特异性实时定量RT-PCR分析揭示Rcb HLH基因主要在花瓣中表达。酵母双杂交结果显示,Rcb HLH能与Pav MYB和Pav WD40相互作用形成MYB-b HLH-WD40复合物。以上结果为进一步研究Rcb HLH的功能鉴定奠定了基础。     

鸡白细胞介素2的克隆及其序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究鸡免疫刺激因子白细胞介素2(IL-2),探究IL-2蛋白结构。根据GenBank发表的IL-2序列设计引物扩增IL-2基因,将其克隆到p GM-T载体后进行鉴定,鉴定正确的pT-IL-2重组质粒,然后对其进行序列分析。应用生物信息学软件对IL-2序列进行跨膜区、磷酸化位点、氨基酸序列、开放阅读框进行分析和IL-2蛋白的三级结构进行预测。核苷酸序列测定结果表明:IL-2基因片段为430 bp,编码143个氨基酸。生物信息学分析结果表明:本实验获得的IL-2基因编码的蛋白质中含有1个丝氨酸和3个苏氨酸,这可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。IL-2蛋白可能在5~28位含有跨膜区。其蛋白二级、三级结构预测结果显示其属于亲水性蛋白,多为α-螺旋、β-转角和N端无规卷曲结构。该结果为IL-2的分子生物学探究奠定了基础。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。