胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶Pn4CL基因的克隆及表达分析

根据胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL）基因的部分序列设计引物,运用RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为Pn4cl,长度2130 bp,开放阅读框1638 bp,编码545个氨基酸。预测Pn4CL分子量为59.57 kDa,理论等电点为5.70。该基因含有AMP-binding（AMP-binding enzyme）、CaiC[Acyl-CoA synthetase (AMP-forming) /AMP-acid ligaseⅡ]、PLN02246、AFD-class I等结合域,具有植物4CL所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn4CL与北细辛的同源性最高,同时与木兰分支类植物的4CL聚类在一起,与菊分支的进化距离较近,与蔷薇分支的进化距离较远。亚细胞定位表明,该蛋白定位在细胞膜上。Real-time RT-PCR结果表明,该基因受外援激素SA和MeJA诱导表达,同时接种辣椒疫霉菌后,Pn4CL基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn4CL的功能研究提供了理论依据。     

芒果中性/碱性转化酶MiNI基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术克隆了1个编码NI基因的cDNA序列,命名为MiNI基因,并对不同来源的中性/碱性转化酶的分子特征及系统进化进行比较分析。结果表明：MiNI基因开放阅读框为2034 bp,编码677个氨基酸,相对分子量为76.6 kDa,理论等电点为6.24;生物信息学分析结果显示,NI二级结构α螺旋占38.85%,无规则卷曲占35.45%,伸展链占18.91%,β折叠占6.79%;MiNI具有glycoside hydrolase family 100结构保守域,与克里曼丁桔、龙眼、巴西橡胶树和番木瓜都具有一致的motif位点;MiNI基因编码的氨基酸序列与克里曼丁桔、龙眼氨基酸序列同源性最高;构建NI系统进化树分析表明,与芒果遗传距离最近的是克里曼丁桔,最远的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析显示,果皮MiNI基因表达量远高于果肉;花后10~40 d,果皮MiNI基因表达量显著下降;花后40~100 d,果皮MiNI基因表达量维持在一个相对稳定水平;花后100~130 d,随着果实成熟,果皮MiNI基因表达量又显著上升;而花后10~40 d,果肉MiNI基因表达量显著下降,至果实发育后期果肉MiNI基因表达量始终处于极低水平。该研究为进一步了解MiNI基因在芒果果实蔗糖代谢过程中的作用以及从分子角度阐明芒果糖代谢机理奠定理论和技术基础。     

柽柳MnSOD基因

在环境胁迫下,植物体内活性氧(ROS)的大量积累会对其本身产生毒害作用。SOD酶在清除这些活性氧化酶机制中发挥关键作用。大量研究表明,MnSOD可有效增强转基因植物抵抗氧化胁迫的能力。我们从抗逆性较强的木本植物紫杆柽柳中克隆到一个新的MnSOD基因,并将该全长基因在GenBank上注册,其登录号分别为AY573576(基因序列)和AAS77885(氨基酸序列)。这将为研究木本植物的抗逆机理和该酶在抗逆基因工程中的应用奠定基础。     

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3 385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3 382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135AG和g.54412107CA 2个位点。Izumo1基因g.54412135AG位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107CA在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P0.01);群体遗传学分析得出g.54412135AG多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC0.25);g.54412107CA多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25PIC0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135AG和g.54412107CA位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P0.05)。     

一个潜在催化莱鲍迪D苷合成的新型糖基转移酶

尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate glycosyltransferases,UGTs)催化糖基转移反应,与植物次生代谢密切相关。本研究根据甜叶菊(Stevia rebaudiana)转录组数据库,克隆到一个催化莱鲍迪D苷(rebaudioside D,RD)合成的新型糖基转移酶候选基因,对其开展生物信息学分析。结果表明,该基因开放阅读框长1380 bp,编码459个氨基酸,等电点(pI)预测为5.54,理论分子量约49.66 kD,系统发育分析表明该基因与向日葵中的UGT89A2同源,故将其命名为SrUGT89A2。构建pET28a-SrUGT89A2原核表达载体,并在大肠杆菌(BL21(DE3))中诱导表达得到重组蛋白,HPLC检测表明粗酶液能催化甜叶菊提取液形成一个新的色谱峰,该峰保留时间与莱鲍迪D苷一致。经进一步纯化UGT89A2蛋白,添加不同甜菊糖苷标准品为催化底物,但未鉴定出该蛋白催化的具体糖苷。该潜在催化甜菊糖RD苷合成的新型糖基转移酶基因SrUGT89A2的发现,为RD苷的生物合成和甜菊糖苷的生物途径研究提供新的理论依据。     

枇杷LEAFY同源基因的克隆及序列分析

为从分子水平研究枇杷成花的机理,通过分析植物花分生组织决定基因LEAFY(LFY)同源基因的保守区序列,设计了1对简并引物,用PCR方法从枇杷栽培品种‘早钟6号’基因组DNA中扩增出1个1317bp的片段,把该片段克隆到pUCm-T载体,测序和序列分析结果表明获得了枇杷LFY同源基因(ejLFY)3’端的1个片段,该片段有1个911bp的内含子,编码区共编码130个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号为AY551183)．在GenBank中进行同源性搜索,发现该基因片段与其他作物中已经报道的LFY同源基因的同源性大都在94％以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到98％的同源性,推测它们具有相似的功能．     

致猪水肿病大肠杆菌鄂E株SLT-IIeB基因的克隆、序列分析及原核表达

以湖北本地分离的致猪水肿病大肠杆菌鄂E株为模板,PCR扩增去掉信号肽和跨膜区的SLT-IIeB基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-KG。同时对筛选出的阳性质粒pGEX-SLT-IIeB进行测序,测序结果与Genbank上发表的12个SLT-IIeB基因序列的同源性达100%,表明该基因保守性很好。重组质粒pGEX-SLT-IIeB经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE分析表明表达产物GST-SLT-IIeB有特异性表达带,Western-blot检测证实表达产物具有免疫反应性。     

H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析

设计特异引物,采用RT—PCR技术,成功从本实验室分离、保存的H6N禽流感病毒毒株（HB2002）中克隆到血凝素基因（HA）序列,该克隆基因全长1714hp,提交GenBank,获得登录号DQ285546。同部分H6,H5,H7,H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A／duck／Hainan／4／2004（H6N2）,A／duck／HongKong／3600／99（H6N2）毒株有99％的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与此2毒株亲缘关系最近。由该克隆核酸序列推导的HA蛋白共566个氨基酸,该蛋白同其他H6亚型AIV的HA蛋白有相同裂解位点序列即PQIETR↓G,无高致病性毒株典型的裂解位点特征,因此,初步判定毒株HB2002为低致病性禽流感病毒．     

大肠杆菌焦磷酸酶基因的克隆和序列分析

按ＣＴＡＢ法提取大肠杆菌Ｋ－１２的ＤＮＡ,应用ＰＣＲ技术获得目的基因片段（ＰＰａｓｅ基因）,低熔点胶回收后,在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下,将目的基因克隆到ｐＵＣｍ－Ｔ载体上,并转化ＪＭ１０９感受态菌中。转化获得的克隆提取质粒ＤＮＡ,０．８％琼脂糖凝胶电泳分析,并进行ＰＣＲ扩增鉴定、序列分析证明插入片段确为ＰＰａｓｅ基因。本文用ＰＣＲ技术扩增并克隆大肠杆菌焦磷酸酶基因,为导入甜菜选育高含糖量品种奠定基     

PCR技术在住肉孢子虫虫种鉴定上的应用

采用 RAPD 方法对水牛梭形住内孢子虫、待定种及黄牛枯氏住内孢子虫缓殖子基因组 DNA 进行了分析,待定种 PCR 产物的电泳带型与枯氏住肉孢子虫的差异较梭形住内孢子虫大,这与二者表型性状一致的研究结果不吻合.对3种包囊种特异性的 PCR 指纹进行了筛选,回收和纯化了3种包囊种特异性的 DNA 片段,待定种0.7kb 片段经α-~(32)PdATP 标记后用作探针,只与同源 DNA 杂交,不与其它包囊、宿主细胞和艾美耳球虫杂交,用 pGEM-T Easy Vector 对该片段克隆成功,并测出其全长序列,为进一步设计特异引物建立标准 PCR 诊断方法和用作核酸探针奠定了基础。