禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达

本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5’端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹（Western blot）法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列（登录号NM₂05152）一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。     

新城疫病毒疫苗株F蛋白裂解位点改造对诱导HepG2细胞发生自噬的影响

新城疫病毒(NDV)通过启动不依赖p53的内源性凋亡通路特异性诱导肿瘤细胞凋亡.最新研究表明NDV可以引起U251肿瘤细胞发生自噬,并在后期导致细胞凋亡,但其机理尚不清楚.本研究通过反向遗传操作技术对NDV Clone30疫苗株F蛋白的碱性裂解位点进行突变,将F蛋白的裂解位点由弱毒株的GGRQGR ↓ L突变为强毒株的GRRQRR ↓ F基序,并成功拯救出突变改造病毒rC30-FmF.分别将Clone30野生型病毒株rC30-wt与rC30-FmF感染HepG2肝癌细胞,通过透射电镜检测细胞超微结构显示,rC30-FmF感染4h后细胞内出现大量自噬小体及自噬溶酶体.通过westem blot检测自噬标志蛋白LC-3 Ⅱ表明,rC30-FmF感染4h后LC3Ⅱ表达量显著上调,与rC30-wt对照组相比差异极显著(p＜0.01).研究表明,rC30-FmF可以在感染早期增加HepG2细胞自噬程度.从而初步证明F蛋白的裂解位点在诱导HepG2细胞自噬过程中具有关键作用.     

鹅IGF-I基因cDNA的克隆、分析与原核表达

从GenBank中读取鸡、鸭、鹌鹑、火鸡等的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因序列进行分析并设计引物,运用RT-PCR法从五龙鹅的总RNA中克隆了IGF-I基因的完整编码区序列(GenBank登录号为DQ662932).运用生物信息学技术对序列进行分析,结果显示:五龙鹅JGF-I基因的编码区长462 bp,与鸭和鸡基因序列同源性分别为99.6%和98.1%;分子进化树进一步揭示了五龙鹅与鸭、鸡及其他动物的进化关系;同源建模分析发现该基因有3个α-螺旋组成.克隆鹅IGF-I基因表达序列,然后连接到pET-32a载体上进行原核表达.经SDS-PAGE分析发现原核表达产物约为28 ku的融合蛋白,Western杂交分析表明,重组蛋白为目的蛋白.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。     

泰勒虫重组抗原Tams1-spag基因原核表达与纯化

为了在低成本的情况下,得到高浓度、高纯度的环形泰勒虫表面重组抗原的融合蛋白,设定表达过程中不同的OD600nm、IPTG浓度与诱导时间,探索最佳表达条件。通过KCl染色法切胶后分别经透析袋电洗脱法与快速离心法回收目的蛋白。对上述试验的蛋白样品进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果表明,在OD600nm=1时加入浓度为1mmol/L IPTG,过夜诱导时,重组蛋白的表达量最大。在KCl染色法切胶回收目的条带的基础上,电洗脱法与快速离心法均能得到同等浓度的高纯度目的蛋白,经Western blot检测重组蛋白的生物活性没有改变,仍具有良好的反应原性。     

鸡传染性贫血病病毒分子生物学研究进展

鸡传染性贫血病病毒 (ＣｈｉｃｋｅｎＩｎｆｅｃｔｉｎｃｓＡｎｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ,ＣＩＡＶ)是鸡传染性贫血病的病原体。ＣＩＡＮ感染可引起雏鸡严重贫血和胸腺萎缩 ,甚至造成死亡 ,亚临床感染可引起食欲下降 ,并导致雏鸡对其它病原如ＩＢＤ、ＭＤ、ＮＤ等的易感性增强 ,是目前严重危害养禽业的病原体之一[1] 。 1979年Ｙａｓａ首次在日本报道此病后 ,德国、瑞典、荷兰、美国也陆续报道了此病。先后在欧洲、非洲及亚洲的鸡中发现它的血清学证据。1　病原特性1.1　病毒的分类地位在国际病毒分类委员会第六次分类报告公布以前 ,ＣＩＡＶ一…     

基于Maize6H-60K芯片精准分型的玉米DH群体遗传规律研究

为解析玉米双单倍体（doubled haploid,DH）群体的遗传规律,使用自主研发的精准分型策略对‘先玉335’DH群体的Maize6H-60K芯片结果进行筛选校正和解析。结果表明：1）通过剔除单态、杂合、缺失标记,使用精准分型策略对标记准确聚类,获得的18 947个SNPs标记覆盖玉米全基因组。2）该群体在10条染色体上平均交换次数为1.84～1.03次,在6号染色体随体区域的交换次数显著减少。3）该群体在1、2、3、8号染色体上存在明显的偏分离现象;通过高频次、高密度的交换,染色体两臂端粒区域理论分离系数表现出回归到50%的趋势。利用获得的重组交换及分离规律可提高从DH群体中筛选到预期育种材料的准确性。     

重组鸡γ-干扰素对肉鸡生长性能和免疫功能的影响

为研究注射重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)对肉鸡生长性能和免疫功能的影响,将90只健康14日龄AA肉仔鸡随机分为3组:对照组、试验组Ⅰ和试验组Ⅱ.于14、21和28日龄每只鸡皮下注射含rChIFN-γ 50μg(试验组Ⅰ)和100μg(试验组Ⅱ)的PBS缓冲液1 mL,对照组同期每只注射PBS缓冲液1 mL.每次注射rChIFN-γ 7 d后,对各组肉鸡进行翅下静脉采血,并于35日龄剖杀肉鸡摘取免疫器官.研究表明:①35日龄试验组Ⅰ的淋巴细胞刺激指数极显著高于对照组(P＜0.01);②35日龄试验组Ⅱ的胸腺指数显著高于对照组(P＜0.05);③35日龄试验组Ⅰ的白细胞介素-2水平显著高于其他各组(P＜0.05);④35日龄试验组Ⅰ的TNF-α水平显著高于其他各组(P＜0.05).肉鸡每7天注射一次rChIFN-γ,可提高35日龄肉鸡的免疫机能,促进肉鸡免疫器官的生长发育.