水稻GA20ox-2基因mRNA的TaqMan荧光定量RT-PCR检测

 成功建立了一项基于TaqMan 实时荧光定量的RT-PCR技术,定量分析水稻半矮化关键基因之一GA20ox-2转录水平。该技术体系中重组质粒标准品的制备方法具有很好的实用性;质粒标准品对基因GA20ox-2表达的实时定量准确、可靠、便捷。标准曲线表明,所建立的GA20ox-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,灵敏度高,可达102拷贝;线性范围广,可达102～107拷贝;扩增效率高（E=100.3%）;稳定性、重复性好,可靠性高,批内和批间变异系数仅分别为0.12%～0.31%和0.21%～0.34%;循环阈值与PCR 体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（^r＝0.999）,可对GA20ox 2基因表达进行准确实时定量。     

牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立特异性强、灵敏度高、重复性好的产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法,本试验根据产气荚膜梭菌的plc基因保守序列设计合成特异性引物探针,摸索其最佳反应条件,进行灵敏性、特异性、重复性以及临床样本验证。结果表明：建立的方法具有较好的灵敏性、特异性及重复性,最低检出限度为8.26×10¹拷贝/μL,在8.26×10³～8.26×10⁸拷贝/μL的范围内具有良好的线性关系,同时不与其他致病菌发生交叉反应,组间及组内的变异系数均小于4%,应用比方法在采集的300份临床样品中检出24份阳性样品,与常规细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。说明试验成功建立了牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法,这将为牛产气荚膜梭菌的快速诊断提供技术支持。     

枣树愈伤组织培养中几种物质的变化研究

枣树愈伤组织在继代培养中,前期(第5～15天)淀粉、还原糖、蛋白质、核酸的含量都在增加;在第15～35天,淀粉和还原糖的含量下降,蛋白质和核酸的含量上升,并在第35天时达到最大值;第35天以后它们的含量都在减少.说明枣树愈伤组织继代培养中,快速增长期在第15～30天,第35天以后生长速度在逐渐减慢.由此确定枣树愈伤组织培养最佳的继代周期为第30～35天.     

稻褐飞虱呼肠孤病毒的核酸结合蛋白

采用Northwestern分子交杂方法，研究了稻褐飞虱呼肠孤病毒（NLRV）结构蛋白的功能，结果证明被推测为RNA聚合酶的P1蛋白、B突起的P2蛋白、NTP结合的P7蛋白和主要的病毒外层蛋白的P8蛋白是非特异性核酸结合蛋白，具有与单链或双链RNA和DNA4种核酸结构的能力，暗示了这4种蛋白在NLRV病毒核酸复制，病毒粒子包装中起作用。     

甜菜黑色焦枯病毒核酸特性,RNA2的cDNA克隆和部分序列分析

以感染甜菜黑色焦枯型病毒新疆及宁夏分离物的苋色藜为材料提纯病毒，提取其ＲＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳后分别回收不同的ＲＮＡ组分，以不同组合接种苋色藜，证实新疆分离物ＲＮＡ１能单独侵染并复制，但ＲＮＡ２组分必须依赖ＲＮＡ１才能完成其侵染和复制过程。同时发现，宁夏分离物ＲＮＡ可以代替新疆分离物ＲＮＡ１支持ＲＮＡ２的复制。通过核酸酶保护试验和对ＢＢＳＶ新疆及宁夏分离物ｃＤＮＡ标记探针与两者的ＲＮＡ进行的Ｎｏｒ     

肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank公布的大肠杆菌O157:H7的菌体抗原基因rfb E、鞭毛抗原基因fli C、溶血素基因hly A、紧密黏附素基因eae A和志贺样毒素基因stx1和stx2的序列,同源性比较后选择保守序列分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针,rfb E/eae A、Stx1/hly A、fli C/Stx2探针5'端分别标记为FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端均标记为BHQ1荧光淬灭基团。通过优化反应体系和程序,建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157:H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度高,stx1、rfb E、fli C、eae A、hly A、stx2的最低检测限分别为20、30、20、20、30和40拷贝数/μL;特异性试验证明,该菌与其他菌种无交叉反应;重复性好,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1 h。将建立的荧光定量PCR体系应用到人工染菌模拟猪肉样品试验中,未富集或富集8 h后测得大肠杆菌O157:H7的最低检出限分别为200 cfu/m L与1 cfu/m L。以上结果表明,本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的方法。     

猪瘟病毒野毒株与疫苗株E2基因双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法的建立

为建立猪瘟病毒(CSFV)野毒株和疫苗株快速定量鉴别检测方法,根据CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差异,设计了2对特异性引物及1条Taq Man探针,以含CSFV HB株和C-株E2基因的重组质粒p BS-E2C和p BS-E2作为标准品,建立了能同时检测CSFV野毒株和疫苗株的双重Taq Man real-time PCR鉴别检测方法。结果表明,建立的CSFV双重Taq Man real-time PCR标准曲线Ct值与1×101~1×106copies/μL之间的E2基因拷贝数呈良好的线性关系,灵敏度达10 copies/μL,且特异性和重复性很好。综上,本试验建立的Taq Man real-time PCR检测方法可用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断及病原定量分析。     

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择DNV融合蛋白保守的编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCRI地,通过检测NDV感染的实验客观存在病料和临床病料,结果表明,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约0.3pg的NDV RNA,攻毒后第8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出DNV,第8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为5/10,第8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为6/10,对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第5天。逆转录套式PCRY应运地临床样品中DNV的最大检出率为6/7,经核酸杂交验证,该法具有很高的特异性和敏感性,也比较简便快速,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用

 利用含PSTVd单体克隆的重组质粒pGEM PSTVd,通过PCR扩增技术,用生物素标记制备cDNA探针,进行杂交反应检测PSTVd,其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达50pg,而用化学发光反应进行判读灵敏度可达5pg,分别是R-PAGE检测灵敏度的26倍和260倍,且2种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高,一次检测样品数量多,且对异地样品检测非常方便,是以往其它检测方法的有效补充。     

蛋白质三级结构预测方法简述

随着各种生物全基因组测序工作的不断深入，越来越多的核酸序列清晰的呈现在世人面前。与此同时，我们明确知道空间结构的蛋白质数目却增长缓慢，而且两者之间增长速度的差异正在进一步扩大。因为蛋白质的生物学功能在很大程度上取决于其空间结构，所以弄清楚蛋白质的结构进而理解其结构与功能的关系具有重要意义。但通过实验方法获得蛋白质结构不仅成本高而且速度慢，