应用DGGE技术研究扇贝养殖海域微型真核浮游生物多样性

为了研究扇贝养殖海区微型真核浮游生物群落多样性,明确养殖扇贝发病时期高丰度微型真核浮游生物种类,探讨微型真核浮游生物与栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)水平传播的可能关系。于2009年和2010年从青岛流清河湾扇贝养殖海区采集了9个月份的海水样品,经25和3 μm的滤膜过滤收集海水中3~25 μm的浮游生物,扩增18S rDNA可变区序列,并利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)技术对扩增序列进行分离以分析微型真核浮游生物多样性。结果表明,该养殖海区微型真核生物包括甲藻、纤毛虫、眼虫、定鞭藻、硅藻、盘蜷虫、隐藻、领鞭毛虫、变形虫和Cercozoan,其中甲藻类和纤毛类生物的最高相对丰度分别达41.0%和38.2%,是海区的优势种类。各月份DGGE谱带聚类分析结果表明,2009年6、7、8、9月份浮游生物群落组成较为相似。中肋骨条藻在扇贝发病前后均有分布。结合相关扇贝AVNV已有的研究结果,研究认为中肋骨条藻是AVNV水平传播的参与者之一,但海区中广泛分布的甲藻和纤毛虫与AVNV传播的关系还有必要进一步研究。     

栉孔扇贝类立克次体自然感染调查及人工感染试验

从 1999年 10月至 2 0 0 1年 3月对导致栉孔扇贝 (Chlamysfarreri)大规模死亡的可疑病原进行了系统调查 ,在栉孔扇贝体内发现 1种细胞内寄生原核生物。根据该原核生物超微形态结构及所形成的包涵体形态特征及染色性质分析 ,初步确定为类立克次体 (Rickettsia likeorganisms ,RLO)。该RLO大小为 (3.6 2 3± 1.4 35 ) μm× (1.343± 0 .32 6 ) μm (n =4 5 ) ,主要寄生在栉孔扇贝的鳃、消化腺的上皮组织中。其感染率和感染强度与水温及栉孔扇贝死亡率呈负相关关系。人工感染试验证明 ,RLO可引起栉孔扇贝感染 ,但不形成大面积明显的组织病理变化。本研究表明 ,RLO对栉孔扇贝不具明显的致病性 ,不是导致栉孔扇贝大规模死亡的主要原因。     

饥饿对不同体重组团头鲂肌肉和血清生化成分的影响

在水温20±1℃条件下,研究饥饿对不同体重团头鲂（141.3±4.23g,96.5±2.88g和76.8±3.17g）肌肉和血清生化成分的影响。结果表明各实验组体重均在饥饿14d后出现显著下降（p<0.05）,至28d时平均降幅为18.78%。饥饿过程中肌肉水分和粗灰分含量均逐步上升,粗蛋白和粗脂肪含量则持续下降,粗脂肪和粗蛋白含量分别在饥饿14d和21d时出现显著下降（p<0.05）。血清中血糖浓度相比甘油三酯和总胆固醇对饥饿更为敏感,饥饿7d后即出现显著下降（p<0.05）,总胆固醇浓度在饥饿14d后差异尚不显著（p>0.05）,21-28d期间才显著下降（p<0.05）,甘油三酯浓度则在饥饿期间持续显著下降（p<0.05）。上述结果说明饥饿对团头鲂肌肉和血清生化成分的影响显著（p<0.05）,体重差异对上述主要指标的影响不显著（p>0.05）。     

不同壳色和性别栉孔扇贝群体的性状相关性及通径分析

为了优化栉孔扇贝(Chlamysfarreri)选育中的亲贝选择策略,以长岛海域栉孔扇贝浅红和棕黄两个壳色群体为研究对象,通过测定壳长(X₁)、壳宽(X₂)、壳高(X₃)、前耳长(X₄)、绞合线长(X₅)、绞合线宽(X₆)6个形态性状,以及湿重(Y)、软体重(Z)和闭壳肌重(W)3个重量性状,采用相关分析和通径分析方法,研究两种壳色群体整体及其雌雄群体与重量性状显著相关的形态性状,分别构建栉孔扇贝形态性状与重量性状间的回归方程。研究结果表明,闭壳肌重的变异系数最高(0.30);棕黄雄性群体壳宽与闭壳肌重不相关,其余群体6个形态性状与3个重量性状间均存在显著相关关系(P<0.05),浅红群体、浅红雄性群体、浅红雌性群体、棕黄群体、棕黄雄性群体、棕黄雌性群体中对湿重(Y)、软体重(Z)直接影响程度最大的形态性状均为壳长,壳长对湿重的通径系数依次为0.602、0.645、0.580、0.527、0.752、0.343,壳长对软体重的通径系数依次为0.677...     

栉孔扇贝对环境变化适应性研究一盐度、pH对存活呼吸、摄食及消化的影响

取体长分别为3和5 cm的栉孔扇贝(Chlamys farreri)置室内水泥池流水暂养1周后,进行盐度和pH变化对其存活、呼吸、摄食及消化影响的实验.结果表明, 栉孔扇贝96 h的半致死盐度为25.在不同盐度的海水中暴露24 h的实验结果为,栉孔扇贝随盐度的降低,出现耗氧率升高,随后逐渐下降,到盐度15时不再耗氧而死亡;滤水率和淀粉酶活性随盐度降低而降低,盐度为15时完全不滤水,淀粉酶完全失去活性.小个体栉孔扇贝耐低盐能力较大个体的略大些.pH降至7.8以下时开始对栉孔扇贝的存活产生影响,降至7.6时,48 h后死亡率为35%左右;7.2时达50%;降至7.0时扇贝不能存活.大个体栉孔扇贝对海水pH变化略敏感于小个体.     

溶藻弧菌对华贵栉孔扇贝体内几种酶活性的影响

对华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）注射不同密度的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）,于注射后6,12,18,48,72h测定体内过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）、碱性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）的活力。结果表明：5×107cell.mL-1,5×108cell.mL-1组血淋巴中CAT活性均有升高趋势,其中5×108cell.mL-1组在18h极显著增加（P≤0.01）,24h显著增加（P≤0.05）。5×108cell.mL-1组SOD活性最初表现为抑制,在12h和18h显著低于对照组（P≤0.05）,24h后明显升高,5×107cell.mL-1组与对照组相比差异不明显。肝脏中ALP活性在18h与对照组相比,5×108cell.mL-1组极显著升高（P≤0.01）,5×107cell.mL-1组显著升高（P≤0.05）。注射后ACP活性有明显升高的趋势,5×108cell.mL-1组在12h和18h显著高于对照组（P≤0.05）,且在注射后24h5×107cell.mL-1,5×108cell.mL-1组活性均达到最高。     

栉孔扇贝秋季苗种培育、生长特性的初步研究

2004年9月20日～2005年5月9日,在红岛蛤原良种开发有限公司贝类育苗场进行了栉孔扇贝Chlamys farreri秋季苗种培育及其生长特性的研究。2004年11月中旬得到的壳高约0.1cm的秋季苗种2.2×106粒,在育苗池中暂养,12月份当水温降到8℃左右时移秋季苗种到保温效果比较好的藻类培育池中培养,苗种可安全过冬。次年5月当海区水温回升到10℃左右时将该苗种移到海上养殖区。2005年5～12月,通过对秋季苗种进行定点采样调查和生物学特性测定,结果表明,扇贝壳高的特定生长率SGR(%/d)在0.22±0.30～3.18±0.41之间,壳高与壳长的关系式为L=0.8101H-0.076,壳高、壳长与体重的关系式分别为W=0.1521H2.6268,W=03625L2.2191,成活率(%)在85±2.45～97.2±2.0之间。5～12月栉孔扇贝没有出现大量死亡现象,顺利地度过了夏季高温期。     

6-DMAP诱导栉孔扇贝异源雌核发育二倍体

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎精子激活栉孔扇贝卵子,运用L9（3^4）设计不同6-DMAP的处理条件来诱导染色体加倍,获得第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体早期胚胎。以雌核发育担轮幼虫为材料,滴片法制备染色体并采用计数法统计倍性,分析不同6-DMAP浓度、诱导时机和诱导持续时间对雌核发育二倍体诱导率的影响,并统计早期胚胎畸形率。结果表明,不同6-DMAP浓度、诱导时机和诱导持续时间对异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的诱导率均有显著影响;早期胚胎畸形率与二倍体的诱导率呈负相关,y=46.632-0.891x（r=-0.813,P〈0.01）。6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的最佳处理条件为：20%～25%受精卵排放出第1极体时,60μg/ml的6-DMAP持续处理25min可得到最高的诱导率为29.5±5.36%。研究结果为6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育染色体加倍提供了一定的细胞学依据和技术参数。     

栉孔扇贝BES-SSR的开发及遗传多样性分析

通过分析栉孔扇贝BAC末端序列,发现大量微卫星DNA;随机选择14个多态性BES-SSR标记,在我国栉孔扇贝大连群体(DL)和青岛群体(QD)中验证标记的可用性,同时对这两个群体的遗传结构及其分化进行研究。结果表明,从17447条BESs中得到微卫星3374个,以四核苷酸重复为主(26.6%),五核苷酸重复次之(17.7%),六核苷酸重复最少(12.0%)。BES-SSR引物的扩增效率为77.3%(99/128),在作图亲本中的多态比例为33.6%(43/128),14个基因座在两群体中的平均等位基因数Na分别为18.9286和26.2143,平均有效等位基因数Ne为11.7505和17.0891,平均观察杂合度Ho为0.5100和0.4204,平均期望杂合度He为0.9156和0.9450,多态信息含量PIC分别为0.8940和0.9302,群体遗传多样性水平较高。两群体间的无偏遗传相似性系数为0.4879,遗传距离为0.7177,平均基因分化指数FST为0.0243,基因流Nm为10.0179,显示群体间遗传分化程度较弱,遗传变异主要来自于群体内个体之间,经Hardy-Weinberg平衡检验,两群体普遍存在杂合子缺失现象。研究表明,所开发的BES-SSR是高度多态位点,用于群体遗传多样性分析效果很好,显示BES是微卫星标记开发和应用的重要资源。