IGF-1毛囊特异表达载体的构建以及转染绒山羊胎儿成纤维细胞的研究

本研究旨在构建绵羊胰岛素样生长因子1(IGF-1)毛囊特异表达载体pCDsR-KI,并转染绒山羊胎儿成纤维细胞,最终获得稳定表达红色荧光并可用于核移植的转基因细胞克隆.通过RT-PCR方法获得IGF-1 cDNA,其与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成IGF-1毛囊特异表达载体pCDsR-KI(大小7.4 kb).以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以lipofectamineTM 2000介导转染所培养的第2代成纤维细胞,在DMEM/F12+10%FBS、37℃、5%CO2中培养,并添加G418筛选,获得了表达红色荧光蛋白的细胞克隆.经PCR法鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.通过分析转基因体细胞的生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数趋于正常.为下一步通过体细胞核移植技术获得转基因克隆绒山羊准备了核供体细胞.     

酵母培养物对隐性乳房炎奶牛免疫功能和抗氧化功能的影响

关于酵母培养物(yeast culture,YC)在反刍动物中的应用的研究已有很多年,以往的研究多集中在对反刍动物生产性能的影响和对单胃动物免疫状态的分析上[1-2].有关YC对反刍动物免疫功能的研究鲜见报道.本试验研究YC对隐性乳房炎奶牛免疫功能和抗氧化功能的影响.     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系的建立

为了建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为良好的体外研究模型,本试验取蒙古绵羊输卵管,运用0.25%胰蛋白酶消化的方法分离上皮细胞进行体外培养.对培养细胞进行形态学、免疫组织化学方法鉴定.原代培养细胞用胰蛋白酶/EDTA方法成功传代,传三代后检测其染色体核型.结果显示,成功获得了原代和传代培养细胞,经鉴定为上皮细胞,传三代后经染色体核型分析显示细胞核型正常,培养的细胞健康状况良好,可以用做体外研究模型.     

奶牛新鲜粪便致病性大肠杆菌分离鉴定

致病性大肠杆菌不仅是全球性腹泻的主要病因而且可导致出血性结肠炎(HC)等多种疾病.与人类疾病相关的致病性大肠杆菌血清型存在于牛肉,牛奶和不少动物的粪便中[1-2].为此,对内蒙古包头规模化奶牛场荷斯坦奶牛的新鲜粪便进行了致病性大肠杆菌的分离鉴定,以期为该地区大肠杆菌病的发生、传播以及进一步研究大肠杆菌的危害性和控制提供依据.     

斯氏副柔线虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

运用PCR方法以保守引物NC5、NC13、NC13r和NC2扩增从内蒙古地区骆驼皱胃分离的3条斯氏副柔线虫（Parabronema skrjabini）rDNA的内转录间隔区1（ITS1）、5.8S序列和内转录间隔区2（ITS2）。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGM-T载体,用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明线虫1（P.sk1）扩增的ITS片段大小为837 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1（298 bp）、5.8S（157 bp）及ITS2（281 bp）序列;线虫2（P.sk2）扩增的ITS1片段大小为372 bp,包含部分的18S、5.8S及全部的ITS1（296 bp）;线虫3（P.sk3）扩增的ITS2片段大小为484 bp,包含部分的5.8S、28S及全部的ITS2（284 bp）序列。同其它属线虫同源性比较ITS2序列同源性在30.2%-60.1%。本研究系首次报道骆驼斯氏副柔线虫的ITS序列,为斯氏副柔线虫分子生物学的进一步研究奠定基础。     

绵羊基因组中内源性绵羊肺腺瘤病毒相关序列的确定

绵羊都含有与绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)密切相关的15~20拷贝内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)相关序列。宿主可利用内源性病毒来预防致病性反转录病毒的感染,一些内源性病毒可以有效地干扰相关外源性病毒的复制。本试验通过分子生物学手段确定了蒙古绵羊基因组中含有enJSRV6和enJSRV10两个内源性病毒基因而内蒙古白绒山羊中未发现。通过比较内、外源病毒LTR序列的酶切图谱,获得专一作用外源性病毒的核酸内切酶M spⅠ、TfiⅠ、BsaWⅠ,如果将酶切与聚合酶链式反应(PCR)相结合,不需要经过测序就可分辨enJS-RV和外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV),形成"酶切-PCR"检测技术,将为绵羊肺腺瘤病的快速诊断提供了新的手段。     

内蒙古绒山羊毛囊发育不同时期皮肤中BMP4基因的表达

试验应用RT-PCR技术对骨形态发生蛋白4(BMP4)基因在内蒙古绒山羊毛囊发育不同时期的表达情况进行了定量检测,为深入探讨该基因对毛囊发育的作用及机理提供线索和依据.     

奶牛环境性乳房炎临床分离株免疫原性分析

试验选择2株大肠杆菌(A1、A2)及2株克雷伯菌(K1、K2 )对其菌体蛋白图谱和全菌抗原转印图谱进行了研究,用建立的全菌包被ELISA试验检测兔血清中抗体水平和交叉保护性,筛选到2株具有典型抗原谱、保护性抗原全面的菌株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

阴外动脉灌注乙酸钠对奶山羊乳腺营养物质摄取和利用的影响

选用体重和产奶量相近的4只安装有阴外动脉血插管的处于泌乳中期的关中奶山羊,采用4×4拉丁方设计,分别灌注乙酸钠0、12、16和24 g/d,研究阴外动脉灌注乙酸钠对乳腺营养物质摄取和利用的影响.结果表明:基础日粮条件下向关中奶山羊阴外动脉灌注乙酸钠与未灌注相比,可使乳脂率显著提高8.00%～11.71%(P<0.05),其他乳成分含量变化不显著(P>0.05).乳腺动脉血中乙酸和挥发性脂肪酸浓度、乙酸、丁酸和挥发性脂肪酸摄取量均有极显著提高(P<0.01).灌注乙酸钠使乳腺动静脉血中氨基酸摄取量有所降低(P>0.05),对葡萄糖和甘油三酯乳腺摄取量没有显著影响(P>0.05).灌注16和24 g/d乙酸钠组动静脉血中必需氨基酸和非必需氨基酸的比值与灌注O和12 g/d乙酸钠组相比显著升高(P<0.05).灌注乙酸钠使乳腺摄取的乳脂前体能转化为乳脂能的效率提高了1.02%～2.04%,氨基酸能转化为乳蛋白能的效率提高了4.07%～9.09%,葡萄糖能转化为乳糖能的效率提高了3.39%～5.08%.