多重PCR-DHPLC法检测转基因棉花品系

根据3种转基因棉花品系的边界序列设计品系检测引物,建立了一种特异性检测转基因棉花品系MON531、MON1445和MON15985的多重PCR-DHPLC方法。以20种不同的转基因及非转基因作物DNA验证该方法的特异性,结果只有MON531、MON15985和MON1445有特异的品系扩增片段峰,而其他转基因和非转基因作物无品系扩增片段峰,表明该方法特异性强。灵敏度实验结果表明3种转基因棉花的检测下限均为1 ng,灵敏度高。建立的方法可用于转基因棉花MON531、MON1445和MON15985品系及含有其成分产品的筛查或定性检测。     

小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达和免疫学活性鉴定

研究小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）H 蛋白生物学活性,为建立PPRV 抗体检测方法提供材料。根据 GenBank 已发表的 PPRV H 蛋白质序列,设计上、下游引物,以 PPRV核酸为模板进行 PCR 扩增,扩增产物克隆至 pET52／LIC 载体中,构建了 pET52／LIC-PPRV H 表达载体。将 pET52／LIC-PPRV H 重组质粒转化大肠埃希菌 BL21（DE3）进行融合表达,经 SDS-PAGE 电泳分析,可见 PPRV H 蛋白成功得到了表达,融合蛋白的分子质量约为75 ku,Western blot 分析表明所表达的重组蛋白可与 PPRV 阳性血清发生特异性反应,说明表达的 PPRV H 蛋白可以作为建立 PPRV 抗体检测的蛋白。     

口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究

利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。     

从日本进境罗汉松中截获移去剑线虫

2016年11月,深圳口岸从日本进境罗汉松中截获一种剑线虫。采用贝曼漏斗法分离线虫,结合形态学、28S rRNA基因序列测定以及构建系统发育树,对分离的线虫进行鉴定。该线虫的28SrRNA基因序列和GenBank数据库中的移去剑线虫Xiphinema elongatum(登录号分别为EF140790、KF430803、KF430802和KF430801)的序列同源性高达99%;其形态特征和测计值与X.elongatum最为吻合;系统发育树表明该线虫和X.elongatum聚为一组。通过以上结果判定截获的线虫为移去剑线虫。剑线虫是一种重要的植物外寄生线虫,我国口岸曾经多次截获剑线虫,剑线虫入侵我国的风险较高。本文首次对日本罗汉松中的移去剑线虫进行了详细的描述,提供了该线虫新的地理分布信息。     

一种重要的植物病原细菌——大黄欧文氏菌

大黄欧文氏菌是一种重要的种传植物病原细菌,影响豌豆的品质而降低其商业价值。本文介绍了大黄欧文氏菌的地理分布、寄主范围、生理生化特性、危害症状、发病规律以及防治等内容。该病菌寄主范围广、中国未见分布报道,深入了解该病菌对防治和植物检疫具有重要意义。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的高效表达和纯化

本研究从鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）SVCV-741毒株克隆鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因（sue—g）,将svc-g亚克隆到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌E．coli BL-21（DE3）后,用IPTG诱导培养,获得菌体总蛋白。用SVCV毒株免疫山羊所得到的抗血清作为一抗进行免疫印迹实验,结果在硝酸纤维素滤膜上检测到50～71 kDa之间的特异性免疫条带,与SVCV糖蛋白预测分子量一致,研究证明了工程茵表达获得的重组蛋白具有与SVCV毒株相同的免疫原性,也证明了该蛋白的糖基化对其免疫表位是非必需的。本研究进一步通过发酵基因工程菌和蛋白质纯化过程,获得大量的鲤春病毒血症病毒糖蛋白,为后期免疫动物获得抗血清储备了原料,也为SVCV的免疫学检测方法的建立奠定了物质基础。     

伪狂犬病病毒实时荧光PCR的建立和应用

伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病,快速检测是有效防控该病的重要措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法,根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法。特异性试验结果表明,该检测方法只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.42pg/μL的总DNA,与PCR方法的灵敏度对比试验表明,其敏感度比PCR至少高10倍。对同一样品进行重复性检测,在组内及组间检测的荧光扩增曲线基本重叠,证实其重复性好。对180份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测,结果发现有52份阳性样品。结果表明,所建立的实时荧光PCR方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。     

美洲型猪蓝耳病病毒高致病性变异株RT-LAMP检测方法的建立

设计两套反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立了检测美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株的RT-LAMP方法。采用RT-LAMP方法与实时荧光RT-PCR方法检测58份病料,结果一致,但RT-LAMP方法的灵敏度大约高出10倍。RT-LAMP方法特异性良好,检测猪瘟、伪狂犬病和细小病毒等均未出现交叉反应。结果表明,建立的美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株RT-LAMP检测方法具有特异、灵敏、高效和简便的特点,在我国猪蓝耳病快速检测领域将有广阔的应用前景。     

非洲马瘟间接ELISA方法的建立及初步应用

为建立检测非洲马瘟间接酶联免疫吸附试验方法,利用重组杆状病毒感染昆虫细胞表达出具有良好抗原性的VP7蛋白,将感染VP7重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液作为包被抗原,通过优化包被抗原浓度、二抗稀释度等,建立了检测非洲马瘟的间接ELISA方法,并进行了初步运用。结果表明,直接利用真核细胞表达VP7蛋白的昆虫细胞裂解液作为包被液可成功建立检测非洲马瘟的间接ELISA方法。     

基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。