半滑舌鳎含sox9基因BAC克隆的筛选及BAC-FISH定位

以本实验室构建的半滑舌鳎BAC文库为基础,通过对其进行有序混合,构建了两步PCR筛选体系;对性别决定相关的sox9基因的序列设计特异性引物,筛选获得阳性单一BAC克隆。利用BAC-FISH技术将包含sox9基因的BAC克隆定位在半滑舌鳎染色体上。结果显示,sox9基因在雌、雄半滑舌鳎的一对常染色体的长臂上分别存在两个杂交信号位点,信号稳定且特异。研究证实了该文库筛选体系的有效性;首次实现了对性别相关的sox9基因在半滑舌鳎染色体上的定位,其结果为揭示sox9基因参与鱼类性别控制的机制提供了重要基础。     

棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀)×鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂)F1染色体制备方法及核型分析

探索了在鱼类大小规格不同情况下制备鱼类染色体的最佳策略和方法,并对棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀)×鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂)杂交子代(俗称珍珠龙胆)的染色体核型进行研究.本研究根据预实验的结果,对所选取的珍珠龙胆幼鱼,采用小鱼游泳法进行前处理,取其鳍条并以冷、热两种不同的滴片方法制备染色体,观察染色体形态并对其染色体核型进行分析.结果显示,选用的染色体制备方法能获得图像清晰、形态良好的细胞分裂相;不同的滴片处理方法细胞分裂指数存在一定差异,即热滴片法的有丝分裂指数为2.58％,明显高于冷滴片法的有丝分裂指数(0.83％),此外,热滴片法所获得的染色体的质量也明显优于冷滴片法.珍珠龙胆石斑鱼二倍体染色体数为48,22对染色体为端部着丝粒染色体,2对染色体为亚端部着丝粒染色体,其染色体臂数(NF)为52,核型公式为2n=48,4st+44t.珍珠龙胆与父本鞍带石斑鱼的染色体数目、核型基本一致,而与母本棕点石斑鱼的核型存在很大差异.研究表明,珍珠龙胆的2n数与其亲本相同,其核型特点符合典型的高位类群鱼类核型特征.在对珍珠龙胆与其亲本的核型进行比较的同时,对已报道的25种石斑鱼进行了核型的比较和综合分析,为石斑鱼的种质鉴定、遗传资源保护利用、育种提供基础资料和理论依据.     

桑沟湾水域叶绿素a在海带收获前后的变化及其影响因素

依据2014年5月和8月2个航次走航和定点连续调查资料,分析了桑沟湾水域叶绿素a的空间分布及海带养殖区叶绿素a(Chl.a)的昼夜变化特征,同时结合所调查的温度、盐度 、pH和营养盐等分布特征,分析了桑沟湾水域Chl.a浓度与理化因子的关系,探讨了海带收获前后Chl.a的变化及其影响因素。(1)走航调查的结果显示,桑沟湾夏季Chl.a浓度显著高于春季。桑沟湾春季表、底层总Chl.a浓度均值分别为(0.67±0.39)和(0.50±0.31)μg/L,表层Chl.a浓度高于底层,春季表层整体表现出自湾内向湾外逐渐降低的趋势;夏季表、底层总Chl.a浓度均值分别为(3.39±1.53)和(3.12±1.43)μg/L,表层Chl.a浓度高于底层。桑沟湾夏季表层Chl.a高值区出现在海带养殖区,低值区出现在贝类养殖区,夏季底层Chl.a高值区出现在贝类和海带养殖区,低值区出现在外海区。(2)定点连续监测结果显示,春季海带养殖区Chl.a浓度变化范围在0.24~0.95 μg/L,均值为(0.70±0.19)μg/L,昼夜波动较小。而夏季海带养殖区Chl.a浓度变化范围在2.01~4.66 μg/L,均值为(3.04±0.82)μg/L,昼夜波动较大。桑沟湾海带养殖区夏季Chl.a浓度显著高于春季。春季海带养殖区营养盐平均浓度及硅磷比、氮磷、硅氮比均显著低于夏季。(3)桑沟湾春季表层Chl.a浓度主要与温度、硅酸盐呈显著正相关,而夏季底层Chl.a浓度与盐度呈显著正相关。桑沟湾海带收获前后Chl.a的变化及分布受温度、硅酸盐、盐度、养殖环境状况和水文环境的共同影响,多元的贝藻养殖模式是影响Chl.a变化及分布的重要因素。     

三疣梭子蟹蜕皮激素受体EcR基因的cDNA克隆及表达分析

通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,EcR基因的表达量在24h后显著低于对照组(P0.05),总体呈下降趋势;低盐(11)胁迫条件下,EcR转录组的表达量呈现先降低后上升的趋势,在12h达到最低,之后逐渐上升,在48h之后显著高于对照组(P0.05)。     

海蜇Frizzled1基因的克隆及在无性繁殖中的表达

采用RACE技术解析了海蜇(Rhopilema esculentum)Frizzled1基因的cDNA和基因组结构:Re-Fzd1基因的全长cDNA为2387 bp,其中编码区为1761bp,编码586个氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Fzd1基因具备Fzd家族共同的结构特征,包括:一个由23个氨基酸组成的信号肽,一个位于N-末端富含10个保守半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域(CRD),一个含有7个跨膜片段的跨膜结构域,以及一个含有5个重要的磷酸化位点的C端尾巴。多序列比对表明,Re-Fzd1基因与刺胞动物贝螅(Hydra echinata)、水螅(Hydra vulgaris)、半球美螅水母(Clytia hemisphaerica)和海葵(Nematostella vectensis)Fzd1具有高度相似性,与来自脊椎动物人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)的Fzd1、Fzd2和Fzd7家族基因也具有较高的同源性。基于N-J法,将人、鼠、爪蟾、斑马鱼和果蝇(Drosophila melanogaster)所有Fzd家族基因系统进化分析显示,除果蝇外,所有Fzd家族成员聚类成4个类群,11个亚家族,海蜇Re-Fzd1基因首先与刺胞动物门的Fzd1聚类在一起,然后与脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7三个家族聚成一个类群,表明脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7家族可能与刺胞动物门的Fzd1起源于同一个共同祖先。Re-Fzd1基因组序列中不含有内含子。实时荧光定量PCR结果显示,Re-Fzd1基因在海蜇无性繁殖的4个发育阶段均有表达,其中,表达量最高的横裂体阶段是表达量最低的稚水母阶段的3.67倍。整体原位杂交显示,在海蜇横裂体时期,Re-Fzd1原位表达在触手、基座及发生横裂的部位。这些结果都表明,Re-Fzd1不但参与了海蜇的早期发育过程,还调控了海蜇无性繁殖的发生。     

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、dNTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化.结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,dNTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L.该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应.使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测.研究表明,实验所建立的OsHV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强.由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料GeneFinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成.本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式.结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低.鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达.鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达.其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调.用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达.研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程.本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制.     

双齿围沙蚕-牙鲆网箱综合养殖模型碳、氮收支的实验研究

在实验室条件下, 设计相同的牙鲆(Paralichthys olivaceus)鱼苗网箱养殖密度(密度5尾/箱, 鱼苗体质量约21 g), 分别与不同数量的双齿围沙蚕(Perinereis albuhitensis, 0 g, 50 g, 70 g, 90 g)混合养殖, 4个实验组分别记作C、S1、S2和S3, 网箱规格为Ф60 cm×30 cm。各实验组设3个平行组, 实验进行40 d。牙鲆和沙蚕在称重前均饥饿24 h, 同时取5尾牙鲆和20 g沙蚕作为实验初始样品。实验期间, 每天07:30和18:00分2次投喂配合饲料, 根据对照组饵料剩余情况适时调整投喂量, 每个实验单元的投饵量基本一致, 此过程中不处理残饵和粪便。实验单元采用微流水, 流量为250~500 L/d。实验期间, 24 h持续微量充气。至实验结束时, 全部生物饥饿24 h。将其全部取出, 擦干体表水分, 称重后置于70℃干燥箱中烘干至衡重, 研磨、分析。结果表明, 对照组(C)的底质积累碳、氮量最高, 各实验组水体净输出的氮和有机碳量以及呼吸碳量分别无显著差异(P>0.05)。饲料是碳、氮输入的主要来源。在输出各项中, 各个实验组水体净输出氮占输出氮比例无显著差异(P>0.05), 而系统净排放氮以对照组所占比例最高, 但与S1和S2组无显著差异(P>0.05); 对照组底质积累氮所占输出氮比例显著高于S2和S3组(P<0.05)。对照组底质积累碳所占比例显著高于其他各实验组(P<0.05); 对照组和S1组的水体净输出有机碳比例显著高于S3组(P<0.05), 而S3组碳净排放占碳输出的比例显著低于对照组和S1组(P<0.05)。碳、氮产投比均以对照组最低。在本研究条件下, 双齿围沙蚕在综合养殖模型中可利用牙鲆网箱养殖产生的残饵和粪便, 减少底质碳、氮积累, 提高产投比, 综合养殖模型既可以降低碳、氮排放, 又可以增加产品产出。结论认为, 网箱养殖牙鲆搭配双齿围沙蚕的综合养殖模型理论上具有可行性, 双齿围沙蚕可以作为牙鲆网箱养殖产生的残饵和粪便的一道有效处理屏障, 此模型在港湾和围堰鱼类网箱养殖中更有意义。

     

不同牙鲆群体遗传力和育种值分析

以牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗病群体(RS)、RS(♂)与从日本引进的日本群体(♀)交配建立的群体(RJ)、日本群体(♂)与RS(♀)交配建立的群体(JR)、以及韩国群体(KS)为基础群体, 通过随机交配建立牙鲆家系, 研究了4个群体作为亲本的育种性能。待所建立的家系生长至19月龄左右时, 测量家系生长性状, 包括全长和体质量, 测量所得数据用SPSS及DMU软件中的REML算法和BLUP方法进行分析。结果显示, 从表型参数可以看出KS(♂)×RJ(♀)杂交后代表现出明显的生长优势。19月龄牙鲆全长和体质量的遗传力分别为0.301、0.295, 都属于中等遗传力。因此, 牙鲆群体具有较好的遗传改良潜力。全长、体质量育种值与其表型值的相关系数分别为0.838和0.827, 且呈极显著相关(P<0.01), 表明个体育种值的预测结果具有较高的准确性。对父母本分别进行育种值比较可知, 父本中KS的育种值最高, 母本中RJ的育种值最高, 因此选用KS(♂)和RJ(♀)杂交可培育出生长迅速的牙鲆新品种。本研究通过比较4个资源群体牙鲆生长性状的育种性能, 并以此作为筛选优良亲本群体的重要依据, 旨在为牙鲆新品种的成功选育奠定理论基础, 同时为牙鲆的进一步遗传改良提供重要的科学依据。

     

循环经济转型下的中国鲆鲽类养殖产业

中国海洋经济进入了一个全新发展时期,海水养殖作为海洋经济重要组成部分,必须深入贯彻循环经济发展理念,以科技创新为动力,走可持续发展的道路。本文立足于中国鲆鲽类养殖产业现状,系统阐述我国鲆鲽类养殖业在养殖模式、饲料使用、疾病防控、产业组织及其管理方式等方面存在问题,深入分析鲆鲽类产业与循环经济的内在关系,探讨鲆鲽类产业可持续发展的途径与方法,旨在为鲆鲽类产业走循环经济发展道路、实现可持续发展提供对策和思路。