脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。     

Hg2+和Pb2+胁迫对脆江蓠生长及光合生理的影响

采用实验生态学方法研究了不同质量浓度Hg~(2+)和Pb~(2+)胁迫对脆江蓠(Gracilaria chouae)生长及光合生理的影响。实验设置Hg~(2+)质量浓度为0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.25 mg/L和0.5 mg/L,Pb~(2+)质量浓度为0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L和4 mg/L,以未添加重金属的实验组为对照,持续培养7 d,分别测定不同处理藻体的生长速率、光合放氧速率、光合色素含量、叶绿素荧光和光合碳代谢途径中关键酶活等生理生化指标。结果表明,在Hg~(2+)胁迫下,藻体特定生长率(SGR)显著下降(P0.05),质量浓度达到0.5 mg/L时藻体出现负增长;光合放氧速率降低35.48%~77.59%;叶绿素a、类胡萝卜素含量显著下降(P0.05),Hg~(2+)质量浓度高于0.1 mg/L时藻体藻蓝蛋白和藻红蛋白含量显著降低(P0.05);最大光合效率(F_v/F_m)和实际光合效率(Y(Ⅱ))随着Hg~(2+)浓度增加先降低后升高,0.05 mg/L时出现第二个峰值,丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)也出现相似趋势。藻体对Pb~(2+)的敏感程度低于Hg~(2+),Pb~(2+)质量浓度为0.5 mg/L时,光合产氧速率显著下降(P0.05),质量浓度到达1 mg/L时,藻体SGR和叶绿素a、类胡萝卜素出现显著下降(P0.05),而叶绿素荧光参数和藻蓝蛋白含量则无显著性差异;Pb~(2+)质量浓度达到4 mg/L时1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBiSCO)出现显著下降(P0.05),PPDK酶活性则显著上升(P0.05)。实验结果证实:重金属Hg~(2+)和Pb~(2+)胁迫对脆江蓠的生长和光合作用都有不利影响,藻体对Hg~(2+)胁迫的敏感度要高于Pb~(2+),Hg~(2+)质量浓度为0.01 mg/L时,藻体出现胁迫,并随着浓度的增加而加剧,Pb~(2+)质量浓度超过1 mg/L时,藻体胁迫明显。     

UVA补光时间对凡纳滨对虾肌肉主要营养成分影响研究

紫外光A波段(Ultraviolet A, UVA)是自然光的重要组成部分,具有一定的生态功能。本研究选取450尾体重为(9.56±0.10) g的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)以光周期为12L︰12D的全光谱LED灯[光强(1.00±0.02) W/m2]作为背景光源,在不同UVA [光强(1.00±0.02) W/m2]补光时间(0 h, T0 h; 2 h, T2 h; 4 h, T4 h; 8 h, T8 h; 12 h, T12 h)下进行为期28 d的养殖实验。结果显示,在不同UVA补光时长下,对虾肌肉中水分和粗灰分含量无显著差异,T2 h和T4 h组的粗脂肪含量显著增加,T2 h组的粗蛋白显著高于T4 h组外的其他组(P<0.05),T8 h和T12 h组的粗脂肪显著低于其他各组(P<0.05),但两组间差异不显著;T2 h和T4 h组氨基酸总量、必需氨基酸含量和赖氨酸含量均显著高于其他组(P<0.05);凡纳滨对虾饱和脂肪酸(SFA)含量为27.85%~40.70%,单不饱和脂肪酸(MUFA)含量为10.63%~16.31%,多不饱和脂肪酸(PUFA)含量为38.81%~49.61%,其在T2 h和T4 h组显著高于其他各组(P<0.05),且在两组间无显著差异。综上所述,2~4 h的UVA补光时间能够改善凡纳滨对虾肌肉的营养成分。     

中华蛸消化系统组织学结构及消化酶活性研究

为探明中华蛸(Octopus sinensis)的消化机能,明确适宜的投喂频率,减少互残造成的经济损失,本研究对中华蛸消化系统各器官进行组织学观察,并比较了摄食前后各消化器官消化酶活性以及机体营养物质的代谢水平的变化。结果显示,中华蛸嗉囊、胃、盲囊和肠由黏膜层、黏膜下层和肌层组成,内壁含有较多的褶皱,胃壁肌层最发达,盲囊和肠黏膜褶皱层无护膜;前唾液腺和后唾液腺均为复合管状腺,由腺管及大量的分泌导管组成;肝脏内肝小叶界限不易分辨。中华蛸摄食后,胰蛋白酶活性显著高于脂肪酶和淀粉酶活性。肝脏是分泌消化酶的重要器官,胰蛋白酶活性在肝脏最高为(148.74±21.25) U/mg,淀粉酶和脂肪酶活性在肝脏和胃最高。摄食后血浆总蛋白在120 min达到最低值后上升,血糖和肌糖原浓度在200 min达到最大值后下降,血浆胆固醇和血浆甘油三酯浓度变化幅度较小。消化过程分为2个阶段：第1阶段食物进入嗉囊和胃部,肝脏分泌大量胰蛋白酶,机体的营养物质为消化过程供能,含量下降;第2阶段胰蛋白酶活性处于较高水平,营养物质逐步被消化吸收。中华蛸完整的消化吸收过程约400 min,研究表明,中华蛸养殖生产中适宜的投喂间隔时间为6~7 h。     

饲料中淀粉和糊精对红鳍东方鲀生长和低氧耐受性的影响

在水产养殖鱼粉鱼油供应相对紧缺的背景下,充分挖掘碳水化合物(糖类)的营养功能具有重要意义。低氧是水产养殖中一种常见的环境应激。大量研究表明,鱼类在低氧条件下主要利用糖来提供能量,但饲料糖源对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的生长和急性低氧耐受性尚未见报道。本研究分别在饲料中添加玉米淀粉或糊精(玉米淀粉水解物)作为糖源,养殖8周后,测定生长、急性低氧存活率、代谢产物和低氧诱导因子(HIF)信号通路等指标。结果显示,与淀粉组相比,糊精虽然不会影响红鳍东方鲀的生长性能和鱼体成分,但显著提高了其在急性低氧条件下的存活率。在常氧条件下,淀粉组和糊精组肝脏的糖原和乳酸含量均无显著差异(P>0.05),但在低氧条件下,糊精组肝脏的乳酸含量和乳酸脱氢酶基因表达量均显著高于淀粉组(P<0.05)。同时,糊精组肝脏hif-1α (hypoxia inducible factor 1 subunit alpha)和hif-3α (hypoxia inducible factor 1 subunit alpha, like)、肌肉hif-1α和vegfa (vascular endothelial growth factor A)的表达量均显著高于淀粉组(P<0.05)。在低氧条件下,糊精组血清甘油三酯(TG)含量显著升高,但淀粉组血清和肝脏的TG含量在低氧后却显著下降(P<0.05)。与常氧组相比,糊精组在低氧后的肌肉总蛋白含量、肝脏蛋白激酶B (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1, akt1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase, mtor)基因表达量均显著降低,但淀粉组肝脏的mtor基因表达在低氧后却显著升高(P<0.05)。综上所述,用易消化的糊精替代玉米淀粉激活了HIF信号通路介导的无氧糖酵解来为鱼体提供更多的能量,同时还可以抑制脂肪的分解和蛋白质的合成,减少了O2的消耗,从而提高了红鳍东方鲀对急性低氧的耐受性。本研究结果为鱼类耐低氧饲料的设计和健康养殖提供了重要参考。     

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A. salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A. salmonicida subsp. masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5 µL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5 µL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检     

北部湾口海域深水金线鱼生长和死亡研究

2007年1-12月在北部湾口采集477尾深水金线鱼标本,使用FiSATⅡ软件中的ELEFANⅠ程序包对其生长参数进行了估算.一维方差分析结果表明,北部湾口海域深水金线鱼体长和体质量相关性无显著性性别差异（P>0.05）,雌、雄混合后的体长和体质量关系方程为mt=5.4604×10-5L2.875t;Von Bertalanffy生长方程为Lt=244.7×{1-exp[-0.42×(t+0.37)]},mt=402.3×{1-exp[-0.42×(t+0.37)]}2.875;体质量生长拐点2.3龄,对应体长163.1 mm;逻辑斯蒂方程求解的50％性成熟体长为121.5 mm;体长组成资料的累计渔获量曲线估算的总死亡系数为2.28,Pauly经验公式计算自然死亡系数为0.49,北部湾口海域2007年深水金线鱼的开发率达到0.79,资源处于过度开发状态.Beverton & Holt模型研究表明,当前北部湾口海域深水金线鱼的开捕年龄偏小.建议在当前捕捞力量下,增大tc至2龄,此时深水金线鱼体长为152.3 mm,单位补充量渔获量可达到68.5 g/尾.     

浒苔声反射特征的实验测定

以2008年夏季在中国黄海中南部海域引起绿藻暴发的主要种类浒苔(Enteromorpha prolifera)为研究对象,在消声水池内利用经过校正的、工作频率为70 kHz的Simrad EY500回声探测-积分系统对其声反射特征进行测定,根据浒苔的回声积分等测定值建立了浒苔声反射强度与浒苔密度关系的定量表达式.实验结果显示,浒苔是有效声散射体,其体积反向散射强度(Sv,dB)与浒苔密度(p,g/m3)之间的关系为Sv=17.31g p-95.9,与鱼类目标强度和体长关系具有类似的表述模式.结果证实渔业声学原理和现行渔业声学仪器、方法同样适用浒苔的探测,水声技术可成为下沉浒苔快速监测的有效手段.实验同时显示,浒苔的声散射特征具有其特殊的复杂性,这可能与其可通过光合作用产生气体(氧气)有关.因此,若欲利用声学方法对下沉浒苔资源进行定量评估调查,需对浒苔的生理生化特征进行同步观测研究.     

高温下不同盐度对刺参幼参和 1 龄参呼吸排泄的影响

在实验室中模拟研究了高温(25.3～26.5℃)条件下,不同盐度对刺参(Apostichopus japonicus)幼参和1龄刺参呼吸排泄的影响.根据对盐度的耐受性不同,分别将体质量为(0.03±0.002)g的幼参暴露于盐度梯度为20、23、26、30、35的水体中,体质量为(22.73±9.46)g的1龄刺参暴露于盐度梯度为16、20、25、30、35的水体中进行盐度变化对其呼吸排泄的影响实验,测定其耗氧率和排氨率.结果表明,盐度变化对刺参的呼吸排泄影响显著(P＜0.05).幼参在23～30盐度、1龄参20～30盐度范围内,耗氧率[Rwr,mg/(g·h)]和排氨率[Rwe,μmol/(g·h)]随着盐度的升高而降低,当盐度升高至35时,两者都明显升高(以盐度30为对照),当盐度降至20(幼参)、16(1龄参)时,刺参耗氧率和排氨率均降低.盐度对刺参O:N比值的影响不显著(P＞0.05),各盐度条件下,2种规格刺参的O:N比值平均在14左右,表明本实验条件下该刺参代谢所需要的能量主要南脂肪和碳水化合物提供.从呼吸和排泄的角度来看,在本实验高温(25.3～26.5℃)条件下,幼参在23～35盐度、1龄参20～35盐度范围内具有较好的渗透压调节能力,而幼参在20盐度、1龄参在16盐度下代谢功能较弱.     

长江口及邻近海域无脊椎动物群落结构及其生物多样性研究

根据2006年6月、8月和10月长江口及邻近海域无脊椎动物的底拖网定点捕捞调查资料,研究区域内无脊椎动物的群落结构及其生物多样性.调查共捕获无脊椎动物49种,共2232.277kg、1 037 641尾.分析了调查区域内虾类、蟹类、头足类及口虾蛄4个类别的生物量及密度组成,虾类在密度组成中占主导地位,占总密度的90.1%,蟹类在生物量组成中占主导地位,占总生物量的58.2%.运用相对重要性指数(IRI)研究不同种类的生态优势度,细点圆趾蟹(1 822.64)为6月份的唯一优势种,双斑蝠(1 573.90)及中华管鞭虾(1 135.36)为8月份优势种.三疣梭子蟹(3 667.30)、鹰爪虾(1 568.35)及口虾蛄(1248.70)为10月份优势种.使用多样性指数D、H'、J分析了该水域无脊椎动物群落的多样性,发现在3个航次调查中,10月份多样性指数最高;在不同调查区域,长江口中部多样性指数最高.采用Bray-Curtis指数Cn比较了长江口不同区域的无脊椎动物群落之间物种组成的相似性.结果表明,长江口中部及长江口南部种类组成相似性最高,Cn=0.628;长江口北部和长江口南部种类组成相似性最低,Cn=0.1660与历史资料对比,长江口及邻近海域无脊椎动物主要捕获种类变化不大,群落结构比较稳定.