环境条件对1株假交替单胞菌脱氮效果的影响

从对虾养殖池中分离得到1株具有高效脱氨氮能力的菌株(2906),根据菌株2906的16S rRNA序列分析,该菌与假交替单胞菌属Pseudoalteromonas tetraodonis的亲缘关系最近,命名为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)2906。利用不同C/N、pH、盐度的脱氮培养基,分析了环境条件对该菌株脱氮效率的影响,研究了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、乳糖和可溶性淀粉等不同碳源对菌株2906脱氮效果的影响。结果显示,菌株2906在C/N为15~20、pH为7~8、盐度为5~15时,具有良好的脱氨氮效果。应用柠檬酸钠为碳源,氨氮去除率达100%。在脱氮培养过程中,细菌生长与脱氮效率呈强相关性(相关系数R=0.94)。采用浸泡攻毒方法测试了该菌对幼虾的生物安全性,结果显示,该菌对幼虾的LC50为2.8?107 CFU/ml,表明该菌对对虾不具致病力。研究结果可为该菌的开发利用提供技术支持。     

真鲷虹彩病毒引起养殖斑石鲷大规模死亡的研究

2017年8月,山东省烟台市某养殖场网箱养殖的斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼突然发病并大量急性死亡。疾病调查显示,养殖海域水温为26℃~28℃;病鱼为4~5月龄,全长为(16.3± 1.6) cm,体重为(156.9±37.0) g;80万尾斑石鲷幼鱼2周内累积死亡率达90%以上,经济损失惨重。临诊检查发现,病鱼体表无明显损伤,但活力差、呼吸急促。剖检可见病鱼脾肿大、质地脆、易碎,肾糜烂,肝有出血点。组织切片观察发现,病鱼脾、肾造血组织中可见许多直径约为20 μm的肿大细胞,肿大细胞内含有大量直径约为145 nm、呈六边形的病毒颗粒。用过滤除菌的病鱼脾组织匀浆液,腹腔注射感染健康斑石鲷,感染组14 d内累积死亡率达95%。人工感染病鱼表现出与自然发病鱼类似的外观症状,且在脾、肾组织切片中也可观察到大量的肿大细胞及相似的病毒粒子。使用特异性PCR引物,从自然发病鱼和人工感染病鱼的肝、脾和肾组织中均检测到鱼类虹彩病毒的高强度感染。克隆、测序得到了1362 bp的病毒主要衣壳蛋白基因(MCP),序列比对显示,该病毒的MCP序列与真鲷虹彩病毒(RSIV) RIE12-1的相应序列完全相同。构建的虹彩病毒系统发育树也显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群,是RSIV的一个分离株。本研究首次证实RSIV可以导致斑石鲷大规模死亡,研究结果为诊断和防治斑石鲷病毒病提供了重要参考。     

杀鱼假交替单胞菌2515的抗弧菌效果及在对虾养殖中的应用

为探讨一株杀鱼假交替单胞菌2515 Pseudoalteromonas piscicida(简称菌株2515)在对虾养殖中的抗弧菌效果,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)为指示菌,以鳗弧菌的敏感抗生素新霉素为参比,采用牛津杯打孔法,比较了菌株2515与抗生素抗菌等效关系.设置浓度分别为104 CFU/mL...     

一种复合益生菌对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力的影响

本研究选择1株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL-9、1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-12、1株金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)CDM8,以1∶1∶1将其组成复合益生菌,各益生菌水体添加浓度为107 CFU/ml,进行为期30 d的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖实验。实验分为暂养期(7d)、益生菌处理期(15d)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒期(10 d)。结果显示,养殖水体中添加复合益生菌能显著增加水体和对虾肠道可培养细菌总数(P<0.05),攻毒实验结束时,实验组对虾累积存活率为(73.33±6.83)%,显著高于阳性对照组(25.33±15.43)%。对虾抗病基因热激蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)、β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白(Beta-1,3-glucan-binding protein-lipoprotein,βGBP-HDL)、脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide-β-1,3-glucan binding protein,LGBP)、抗菌肽Crustin在益生菌处理阶段均出现不同程度的上调,在攻毒阶段虽呈现各自不同的表达情况,但所有基因都经历了更大幅度上调。研究表明,水体中添加芽孢杆菌和假交替单胞菌组成的复合益生菌可提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力,对虾抗病力的提高可能与益生菌增加对虾肠道可培养细菌数量、抗病相关基因表达水平及过氧化氢酶(CAT)活性有关。     

抗弧菌杀鱼假交替单胞菌2515的潜在毒性及热处理脱毒后抗菌效果

为评估一株具有弧菌拮抗功能的杀鱼假交替单胞菌2515 Pseudoalteromonas piscicida 2515 (以下简称"菌株2515" ) 对海水养殖动物的毒性, 并确定一种有效的热处理脱毒方法, 在中国明对虾Fenneropenaeus chinensis育苗水体中分别添加浓度为105、 106、 107...     

凡纳滨对虾感染致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的定量分析

对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)携带的pVA1-like质粒所表达的PirAVp和PirBVp毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×105 CFU/ml VpAHPND分离株20130629002S01对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染,于感染后2~9 d采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织,采用实时荧光定量PCR方法,检测各组织中的pirAVp拷贝数。结果显示,感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到pirAVp,其中,肝胰腺在感染后第4天达到峰值, 为8.71×104 copies/mg,而鳃、肌肉、肠道分别在第3、4、5天达到峰值,分别为9.08×103、2.59×104、5.76×104 copies/mg。早期感染鳃组织中先出现VpAHPND的富集,在高死亡发生期,VpAHPND数量在肝胰腺和肠道出现高峰,在死亡数量逐渐下降的后期,各组织的VpAHPND均快速下降,肠道、肝胰腺和肌肉中的VpAHPND水平趋于接近。对虾肝胰腺组织病理切片显示,同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比,濒死对虾表现出更严重的AHPND病理特征,且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重,但检测到的VpAHPND数量呈下降趋势。研究表明,在VpAHPND感染过程中,组织中的pirAVp基因数量不能代表对虾的发病程度,发病程度及组织病理严重的AHPND样品中VpAHPND的数量不一定处于高水平状态。     

基于原位LAMP技术的牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)易感宿主调查

牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)给世界双壳贝类养殖业造成了严重的经济损失。10余种双壳贝类陆续被认定为易感宿主,仍有其他几种贝类仅有PCR核酸阳性数据,因确诊证据不足导致其易感性未得到充分评估。原位环介导等温核酸扩增(LAMP)检测技术相对传统原位杂交技术具有灵敏度高、方便快捷、可作为病原微生物感染证据的优点。为了在OsHV-1流行病学调查过程中实现病毒感染的快速检测和确诊,根据已报道的OsHV-1特异性LAMP检测引物,设计内引物,优化反应条件,建立了OsHV-1的原位LAMP检测方法。基于该方法对2019年以来采集的长牡蛎(Crassostrea gigas)、福建牡蛎(Crassostrea angulata)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、毛蚶(Scapharca subcrenata)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)样本进行检测。结果显示,毛蚶样本的OsHV-1原位LAMP检测结果呈阳性;其他几种贝类部分样本的实时定量PCR (qPCR)检测呈阳性,但原位LAMP检测呈阴性。对毛蚶样本的原位LAMP检测结果分析发现,病毒杂交信号主要分布在外套膜和肝胰腺等器官的结缔组织,推测感染的细胞为成纤维细胞和血淋巴细胞;在闭壳肌和斧足肌肉组织的肌细胞细胞核中也发现较多杂交信号。鳃丝内和周边偶现阳性信号,推测来自渗出的血淋巴细胞。基于原位LAMP技术的OsHV-1检测结果显示,毛蚶是OsHV-1的一种易感宿主,毛蚶结缔组织、肌肉组织和血淋巴细胞对该病毒有强亲嗜性。     

软体动物疱疹病毒及其对贝类养殖产业的危害

中国是贝类养殖大国,30余年来,贝类养殖产量总体稳中有升,但部分贝类的养殖产业因疫病影响出现严重萎缩、甚至消失。20世纪90年代以来,中国多种双壳贝类和杂色鲍(Haliotis diversicolor supertexta)因感染疱疹病毒出现大规模死亡,成为近年来危害中国贝类养殖业的主要病原。经流行病学调查和病原鉴定,引起中国双壳贝类和杂色鲍死亡的疱疹病毒分别为牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)和鲍疱疹病毒(Haliotid herpesvirus 1,HaHV-1)。贝类疱疹病毒病不仅在中国发生,同时也在全球多个国家、地区传播和暴发,引起全球贝类养殖从业者和科研人员的广泛关注。多国学者从病毒特征、流行病学、诊断技术、生态防控和抗病育种等多个角度展开研究,以期减轻此类病毒对贝类产业造成的危害。大量科研力量的投入使OsHV-1和HaHV-1成为分类地位明确,研究最深入、最全面的贝类病毒性病原。本文对近年来OsHV-1和HaHV-1研究领域取得的主要成果进行总结,重点介绍其在中国和全球范围的发生、传播过程、产业危害和防控措施等。     

凡纳滨对虾RAS与WSSV-VP26的相互作用

白斑综合征病毒(WSSV)是对虾养殖中主要的病原之一,病原与宿主作用是介导病毒感染的重要过程。RAS蛋白是Ras基因分泌的保守蛋白,为小G蛋白家族的一员,普遍存在于从酵母菌到哺乳动物的真核细胞中,具有偶联受体和效应系统传递跨膜信号的功能,在细胞增殖和分化中起双重调节的作用,但关于RAS与WSSV的作用尚不明确。本研究将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) Ras基因克隆至pBAD/gⅢA表达载体上,以E. coli Top10为宿主菌,在L-阿拉伯糖的诱导下获得RAS重组蛋白。以Co~(2+)亲和层析方法,获得纯化的RAS蛋白,质谱分析显示,该蛋白为凡纳滨对虾RAS。采用Far-western和ELISA检测方法分析RAS与WSSV结构蛋白VP26、VP28N和VP37的相互作用。Far-western结果显示,RAS与VP26有明显的结合作用,ELISA实验结果显示,RAS与VP26蛋白的相互作用随RAS量的增加而增强。本研究表明,RAS参与WSSV侵染过程,为进一步研究WSSV侵染机制提供了理论基础。     

牡蛎疱疹病毒囊膜蛋白(ORF111)的基因克隆及表达

本研究对编码牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)囊膜蛋白的orf111基因进行了生物信息学分析、克隆和表达。首先,通过特异性PCR扩增得到orf111基因全长序列,并对其编码囊膜蛋白的理化性质、高级结构、跨膜区和抗原决定簇等进行生物信息学分析。结果显示,orf111编码一种稳定的疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域和9个抗原决定簇,同时,氨基酸序列中还包含1个高度保守的精氨酰–甘氨酰–天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)结构域。随后,构建了pET28a-orf111重组质粒,并将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。最后,通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,表达产物分子量约为32 kDa。本研究应用原核表达得到了含RGD结构域的OsHV-1囊膜蛋白,为进一步制备ORF111蛋白单克隆抗体及开展牡蛎疱疹病毒侵染机制的研究奠定了重要基础,为将来OsHV-1的防控工作提供新的思路。