猪流行性腹泻病毒黑龙江分离株ORF3基因的克隆、表达及分子进化分析

克隆2017年黑龙江省大庆地区流行PEDV毒株(HLJ/DQ/2017)ORF3基因,通过真核表达及分子进化分析方法,为研究ORF3蛋白生物学功能提供重要的实验基础。TRIzol裂解法提取病毒RNA,RT-PCR技术扩增ORF3基因片段并测序,克隆至p EGFP-N1载体上,转染至HeLa细胞。应用DNAStar、DNAMAN、MEGA5.0软件进行序列比对和发育树绘制,应用Western Blot技术、Immunofluorescence技术检测ORF3蛋白的表达和细胞定位。经过酶切和测序验证p EGFP-N1载体中正确插入了ORF3基因,Western Blot法、Immunofluorescence法证实ORF3-EGFP融合蛋白聚集成核表达在HeLa细胞质的局部,由进化树分析显示,该毒株和2015年黑龙江地区流行的两个株毒株(HLJ/2015/116、HLJ/2015/DP1-1)位于同一群,但相比2011年黑龙江地区爆发的毒株(CH/HLJ/HH-2/2011),前者亲缘关系更近一些。融合蛋白ORF3-EGFP在HeLa细胞中聚集成核表达,遗传进化分析表明,该毒株与2015年黑龙江省流行的PEDV毒株相比无较大变异,且为目前世界最为流行的PEDV毒株类型。     

猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建及融合蛋白的表达

E蛋白是猪流行性腹泻病毒的小膜蛋白,为了研究E蛋白在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,构建了PEDV E基因的真核表达载体。通过RT-PCR技术扩增E基因片段,经双酶切连接至pEGFP-N1载体,酶切鉴定及测序结果证实PEDV E基因成功克隆到pEGFP-N1中,并将重组质粒命名为pEGFP-N1-E。将pEGFP-N1-E转染He La,利用Western Blot和免疫荧光技术检测pEGFP-N1-E的表达以及定位情况,结果显示pEGFP-N1-E在He La细胞中成功表达,并且在胞质胞核均匀分布。结果表明:pEGFP-N1-E已被成功构建,并且在He La细胞中正确表达。为后续研究关于E基因的功能及其在抗病毒中所发挥的作用等方面奠定了研究基础。     

黑蒜提取液对金葡菌Trap蛋白诱导特异性免疫应答的影响

为研究黑蒜提取液对抗原诱导机体产生的特异性免疫应答和免疫保护作用的影响,将小鼠随机分为佐剂对照组、Trap(Target of RNAIII Activating Protein)对照组、黑蒜高剂量组、黑蒜低剂量组、生蒜高剂量组、生蒜低剂量组。持续灌胃给药4周后免疫注射金黄色葡萄球菌Trap蛋白,2周后加强免疫。二免1周后收集小鼠脾淋巴细胞,用Trap蛋白体外刺激,检测淋巴细胞增殖及其分泌的细胞因子水平。二免两周后采集血清,间接ELISA法检测Trap特异性IgG及其亚类,并用金黄色葡萄球菌Newman菌株攻毒。结果显示:黑蒜提取物高剂量组和低剂量组能显著提高血清抗Trap IgG和IgG2a,上调IFN-γ、IL~(-1)7a分泌水平,促进淋巴细胞增殖,提高攻毒保护率,且明显优于生蒜高剂量组、低剂量组和Trap对照组。为Trap的增强疫苗免疫效果提供了实验依据。     

表达PEDV-S1蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建及鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪严重腹泻和死亡,给养猪业造成巨大经济损失。根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)调节动物胃肠道菌群平衡的功能和结构特征,选择其作为PEDV S1蛋白表达的宿主菌,构建重组基因工程枯草芽孢杆菌。实验将重组质粒p LA-PEDV-S1电转至枯草芽孢杆菌,提取枯草芽孢杆菌的重组质粒,采用PCR、Western blot和免疫荧光方法鉴定阳性质粒DNA。获得了重组pLA-PEDV-S1/B.Subtilis,S1蛋白成功展示表达在菌体表面,重组PEDV S1蛋白能够和猪源PEDV阳性血清结合,具有反应原性。该重组菌可能成为预防PEDV感染的口服疫苗候选菌株。     

一个金黄色葡萄球菌蛋白磷酸酯酶基因的克隆表达及酶活性测定

金黄色葡萄球菌是一种引起人畜多种感染的主要病原菌,开发治疗金黄色葡萄球菌感染的新药途径之一是药物寻靶。研究克隆了一个金黄色葡萄球菌基因,并进行了蛋白诱导表达和酶活性测定。结果表明,该基因编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶活性。实验结果为进一步挖掘该蛋白作为药物靶标的潜在功能奠定了基础。     

沃尼妙林对脂多糖诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14表达的影响

探讨沃尼妙林对脂多糖诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14表达的影响。通过Real-Time PCR和Western Blot检测细胞TLR4和CD14的表达情况,发现脂多糖刺激RAW264.7细胞后,可导致TLR4和CD14表达的增高;不同浓度的沃尼妙林预处理能够抑制脂多糖诱导的TLR4和CD14的表达,并且呈剂量依赖性。结果表明,沃尼妙林具有抗炎作用,可以明显改善LPS诱导的急性肺损伤。     

抗停乳链球菌GapC_(1-150aa)单克隆抗体的制备及生物活性

为了深入研究停乳链球菌Gap C蛋白的抗原性,用原核表达的Gap C免疫优势片段—Gap C1-150aa蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备获得3株抗停乳链球菌Gap C1-150aa蛋白不同表位的单克隆抗体1F2、1E11和5B7。经鉴定确定,3株单抗均Ig G1亚型,其轻链均为κ链,3株单克隆抗体均能与停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的Gap C发生特异性反应而不与其他细菌蛋白发生反应,均具有显著的调理活性,并且具有一定的被动免疫保护作用。     

跨学科培养生物信息学创新型研究生

该文分析了跨学科培养生物信息学研究生的重要性及优势与不足,并简析培养过程中的制约因素,提出跨学科培养生物信息学研究生的相关举措,以促进培养跨学科生物信息学高层次人才。