飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析

 【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。     

飞蝗载脂蛋白对卵巢发育和脂质沉积的影响

【背景】脂质是生物体重要营养素之一,对于昆虫滞育、飞行、胚胎发育和能量调节至关重要。载脂蛋白（apolipophorin,apoLp）是昆虫脂蛋白颗粒的蛋白质部分,主要负责组织之间脂质转运。【目的】以世界性农业害虫飞蝗（Locusta migratoria）为研究对象,通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对其载脂蛋白生物学功能进行分析,探究载脂蛋白在飞蝗卵巢脂质运输中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】利用RNAi技术,分别对羽化后第1天（1 PAE,post adult eclosion）的成虫2个载脂蛋白基因（LmapoLp-II/I和LmapoLp-III）进行dsRNA注射,以ds GFP为对照,每头注射15μg dsRNA;分别解剖羽化后第4、6、8天的卵巢进行观察;取羽化后第8天的卵巢,以EF1α作为内参基因,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测沉默效率;利用脂质组学技术测定并分析对照和沉默LmapoLp-II/I后飞蝗卵巢脂代谢物差异,采用OPLS-DA模型的差异倍数（FC）、P值和VIP值相结合的方法筛选差异脂质;制备冰冻...     

飞蝗双链RNA降解酶的抗体制备及组织定位

【目的】双链RNA降解酶(dsRNA degrading enzyme, dsRNase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsRNA降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据。【方法】通过对LmdsRNase2和LmdsRNase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的LmdsRNase2和LmdsRNase3抗原序列(R2'、R3')进行后续的研究。根据LmdsRNase2和LmdsRNase3的cDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH I、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L~(-1),37℃下诱导4 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达。大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2'和R3'蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得LmdsRNase2和LmdsRNase3的多克隆抗体。利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Western blot检测抗体的特异性。提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体检测其表达量。最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白进行亚细胞定位。【结果】通过氨基酸序列比对发现,LmdsRNase2和LmdsRNase3具有37%的序列一致度,选取特异的序列R2'和R3'设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD。在IPTG浓度为0.5 mmol·L~(-1)条件下,37℃诱导4 h后,目的蛋白在包涵体中大量表达。扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85%的R2'蛋白,可直接用于免疫;而R3'蛋白的纯度低于85%,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大白兔,36 d后取抗血清进行检测,效价均达到1:102 400,表明抗体效果良好。用多克隆抗体杂交实验室保存的His-LmdsRNase2和His-LmdsRNase3融合蛋白,对抗体进行特异性检测,结果表明R2和R3的抗体分别特异性识别LmdsRNase2和LmdsRNase3,无交叉杂交现象,且条带与His抗体杂交到的条带大小一致。采用Western blot方法检测,发现LmdsRNase2蛋白在中肠组织中高表达,但在中肠液中未检测到可见表达,LmdsRNase3蛋白在中肠组织和中肠液中均未检测到表达。进一步采用免疫组化方法对两个蛋白进行组织定位,发现LmdsRNase2和LmdsRNase3均在中肠细胞质中表达,但LmdsRNae3的表达量较低。【结论】成功制备了特异性良好的飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3抗体,Western blot和免疫组化分析表明LmdsRNase2在中肠细胞质中高表达,而LmdsRNase3的表达量很低。研究结果为飞蝗中肠两个dsRNA降解酶LmdsRNase2和LmdsRNase3的功能分化提供了蛋白水平的证据。     

东亚飞蝗几丁质酶家族基因的表达特性与功能研究

 【目的】研究东亚飞蝗几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在蜕皮发育中的生物学功能,筛选在飞蝗发育过程中致死性的几丁质酶基因,为实现基于RNAi的飞蝗有效控制提供重要的基础数据。【方法】在东亚飞蝗EST数据库搜索几丁质酶基因片段,用生物信息学方法分析所获得的基因片段序列;以飞蝗不同龄期第4天若虫和5龄东亚飞蝗不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,应用RT-PCR方法研究时空表达特性;选取在表皮高表达的几丁质酶基因LmCht6,采用RNA干扰方法研究其生物学功能。【结果】基于东亚飞蝗EST库搜索和进一步的序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段;不同组织部位与不同龄期RT-PCR结果表明这7条几丁质酶基因的时空表达特性存在明显差异,其中LmCht6主要在表皮表达;LmCht6的RNA干扰试验表明：2龄飞蝗注射dsLmCht6后,其几丁质酶基因LmCht6表达量明显降低;飞蝗从2龄到3龄的龄期转化过程中,表现为发育延迟,新表皮与旧表皮无法完全分离,导致死亡率达到72.2%。【结论】东亚飞蝗拥有多个几丁质酶基因,它们的时空表达特性存在差异;LmCht6在飞蝗蜕皮过程中具有十分重要的生物学功能,该基因被沉默后飞蝗无法完成蜕皮而导致死亡。     

农杆菌介导创伤胚转化的应用

[目的]优化农杆菌介导创伤胚转化的方法,提高转化率,培育具有特定功能的转基因品种,改善作物的生存能力和生态环境适应力。[方法]参照农杆菌划胚介导植物萌发种子基因转化方法,以燕麦、玉米和高粱的萌发种子为试验材料,农杆菌菌株LBA4404(含质粒P3301ubi Ac)侵染转化燕麦、玉米和高粱的萌发种子,优化转化条件,探索燕麦、玉米和高粱遗传转化体系,探讨菌液浓度、种子萌发时间、超声波功率、乙酰丁香酮和草丁膦浓度对3种作物的影响并进行比较分析。[结果]农杆菌菌液浓度为0.6OD600≥0.4时转化效果最佳;第1次超声波功率为900 W,处理时间为10 min;第2次超声波功率为200 W,处理时间为4 min效果最佳。转化效率最高;添加乙酰丁香酮对燕麦、高粱和玉米的发芽有明显促进作用,但转化效果有明显区别;燕麦、玉米和高粱的转化植株对草丁膦的耐受性差异不大,与非转化植株相比,0.8 mg/L除草剂胁迫下燕麦、玉米和高粱种子萌发受到一定程度的抑制。用1 mg/L除草剂溶液对T0和T1代转化植株幼苗进行筛选,转化植株的存活率高于对照。[结论]经除草剂筛选和PCR对T0和T1代幼苗检测,初步证明获得了转化植株。     

中华稻蝗（Oxya chinensis）对重金属镉的累积及排泄

为了研究重金属镉（Cd）在植食性昆虫体内的累积和排泄规律,通过Cd慢性染毒的方法,用不同浓度Cd溶液培养的麦苗饲喂中华稻蝗（从4龄若虫至成虫）,采用原子吸收法测定Cd在中华稻蝗（Oxyachinensis）整虫和中肠的蓄积及Cd在其粪便和蜕中的排泄量。研究结果表明,Cd在中华稻蝗整虫和中肠中的累积规律相似,即随着麦苗中Cd含量的增加,整虫和中肠中Cd的累积量明显升高,且各处理间存在显著差异（P〈0.05）。部分Cd可以通过粪便的排泄和蜕皮过程而排出体外。用不同Cd浓度的麦苗饲喂中华稻蝗后,其粪便和蜕中的Cd排泄量与对照组相比显著升高（P〈0.05）,且各处理间差异显著（P〈0.05）。中华稻蝗整虫、中肠、粪便和蜕中的Cd含量与食物（麦苗叶片）中的Cd含量存在显著的剂量-反应关系,其相关系数分别为：整虫0.977、中肠0.920、粪便0.967、蜕0.840。研究结果可为进一步研究Cd在中华稻蝗体内积累和排泄的动态变化规律提供理论和实验依据。     

镉长期暴露对中华稻蝗抗氧化机制的影响

采用生长于Cd2+污染条件下的小麦苗喂养中华稻蝗的慢性染毒方法,研究了Cd2+胁迫对中华稻蝗SOD、CAT、GPx活性和H2O2浓度的影响.结果表明,在Cd2+的作用下,中华稻蝗体内SOD、CAT、GPx活性和H2O2浓度均发生变化,表明Cd2+可导致中华稻蝗体内产生ROS.SOD、CAT、GPx 3种酶对Cd2+有一定的耐受性:当Cd2+浓度在这3种酶的耐受范围内,酶活性提高,反之酶活性降低.Cd2+与抗氧化系统间的关系复杂,SOD、CAT、GPx共同承担清除ROS、保护中华稻蝗的重要作用.     

镉急性染毒对中华稻蝗精卵巢小分子热休克蛋白基因表达的影响

小分子热休克蛋白(s HSPs)能够被环境胁迫诱导,采用不同浓度氯化镉(Cd Cl2)溶液对中华稻蝗5龄若虫进行急性染毒,利用Real-time PCR技术对5个小分子热休克蛋白基因Oc HSP19.1、Oc HSP19.8、Oc HSP20.4、Oc HSP20.7和Oc HSP21.1在精巢和卵巢的表达进行了分析。结果表明:在精巢内,Oc HSP19.1和Oc HSP19.8基因经0.16μg·μL-1Cd2+处理,其在不同处理时间的表达水平与对照组相比均显著升高;经0.32μg·μL-1Cd2+处理,其在2 h表达水平最高,之后显著降低;经0.48μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP19.1基因在2 h和6 h的表达量均高于对照组,在12 h的表达量低于对照组,Oc HSP19.8基因在2 h的表达量高于对照组,在6 h的表达量低于对照组,之后二者表达量都显著升高,在36 h表达量最高,分别为对照组的6.3倍和5.4倍。在卵巢内,Oc HSP19.1和Oc HSP21.1基因经0.16μg·μL-1和0.48μg·μL-1Cd2+处理,其在不同处理时间的表达水平与对照组相比无显著差异;经0.32μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP19.1基因在6 h和12 h的表达水平高于对照组,但在24 h低于对照组,Oc HSP21.1基因在2、6、12 h和24 h的表达水平与对照组相比均显著降低,但二者都在36 h表达量最高,分别为对照组的4.8倍和4.6倍;经0.16μg·μL-1和0.48μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP20.7基因在2 h表达水平高于对照组,经0.32μg·μL-1Cd2+处理,该基因的表达水平随着时间的延长出现先升高后降低的趋势。Oc HSP21.1基因在精巢内和Oc HSP20.4基因在卵巢内的表达水平与对照组相比无显著差异。研究结果显示,Cd急性诱导中华稻蝗5个Ocs HSPs基因在精巢和卵巢的表达模式不同,其表达量与Cd浓度和作用时间相关。     

梨小食心虫谷胱甘肽S-转移酶基因序列分析及其与吡虫啉的相关性

为明确梨小食心虫Grapholita molesta谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）对吡虫啉的代谢作用,基于不同亚致死浓度吡虫啉处理的梨小食心虫转录组数据库进行筛选,并通过生物信息学分析、系统发育树构建、保守位点序列比对、分子对接和表达谱分析来确定梨小食心虫代谢吡虫啉过程中的关键GST。结果显示,共筛选到梨小食心虫的17个GST基因,其中GmGSTS1、GmGSTD2、GmGSTE5和GmGSTE4基因编码的蛋白与苹果蠹蛾Cydia pomonella的GST蛋白有较高的相似性,相似度达69.12%～89.66%。梨小食心虫GmGSTD2蛋白G位点和H位点的保守氨基酸与褐飞虱Nilaparvata lugens及烟粉虱Bemisia tabaci代谢吡虫啉相关GST氨基酸序列完全一致。吡虫啉与梨小食心虫GmGSTD2蛋白G位点的ARG-66和H位点的TYR-112可以形成稳定的氢键;与GmGSTE3蛋白G位点的LEU-45和H位点的LYS-123可以形成稳定的氢键。在吡虫啉处理后,梨小食心虫体内GmGSTD2和GmGSTE3基因的表达量显...