凡纳滨对虾致病菌Shewanella putrefaciens WS13中crp基因无痕敲除体系构建及功能验证

以crp为靶标基因，建立凡纳滨对虾腐败菌株腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)WS13无痕敲除方法，初步研究crp基因对S. putrefaciens WS13生物被膜形成的影响。利用Pir蛋白依赖的质粒p MMB1构建缺失载体，利用质粒pBBR1MCS-2-PaacC1构建回补载体，通过同源重组方法，实现对crp基因的无痕敲除，琼脂糖凝胶电泳和测序比对结果表明成功获得crp缺失株(Δcrp)和回补株(Ccrp)。通过对S. putrefaciens WS13野生型(WT)、Δcrp和回补株Ccrp形成的生物被膜作定量分析，发现突变株Δcrp生物被膜量明显下降，回补菌株Ccrp的生物被膜量相对Δcrp明显上升，揭示crp影响S. putrefaciens WS13生物被膜形成。研究结果表明，质粒pMMB1和pBBR1MCS-2-P_aacC1可用于S. putrefaciens WS13基因无痕敲除与回补，成功实现对靶标基因crp无痕敲除，并证实crp是影响WS13生物被膜形成的关键基因。     

黄芪多糖在草菇冷藏保鲜中的应用

分析4℃处理24、48 h的草菇（Volvariella volvacea）渗出液代谢组；用200μmol·L-1黄芪多糖溶液浸泡草菇后在4℃放置24、48 h，测定草菇β-葡萄糖苷酶活性和转录组，检测糖基转移酶基因VVO＿02307表达量。结果表明：4℃处理24、48 h草菇渗出液代谢组分明显不同；与4℃处理24 h草菇比较，处理48 h的草菇中蔗糖含量较低，亚油酸含量较高。与对照比较，黄芪多糖溶液浸泡的草菇在4℃处理24 h时自溶不明显，β-葡萄糖苷酶活性显著降低。转录组分析结果显示，黄芪多糖增强草菇对低温胁迫的耐受性，可能是通过提高N-聚糖生物合成通路活力实现的。研究结果可为草菇低温保鲜技术研发提供参考。     

基于RPA技术对转CP4-EPSPS基因产品的快速检测

核酸检测在农产品安全检测中的应用十分广泛，随着转基因作物的商业化种植，迫切需要一种快速、特异、灵敏的转基因作物检测方法。利用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术对含有转基因产品及其制品中CP4-EPSPS基因进行检测，共设计5对引物来筛取最佳引物，并对反应体系和反应温度进行优化。结果表明，该方法采用20 μL体系在37 ℃恒温反应15 min即可对CP4-EPSPS基因进行快速检测。该方法检测转基因的灵敏度阈值为45拷贝，灵敏度高、特异性强，为大规模筛查CP4-EPSPS基因提供了一种新的途径。     

壳寡糖对黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞毒性损伤的干预作用

为了研究壳寡糖（COS）对黄曲霉毒素B1（AFB₁）诱导大鼠肝细胞（BRL 3A细胞）毒性损伤的干预作用。采用CCK-8法分别测定AFB₁对细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）和COS对细胞的无损害作用浓度；用试剂盒检测COS预处理细胞6 h后再加入AFB₁继续培养24 h的细胞存活率、活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性和细胞凋亡率；通过Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）测定Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1、Bax和Bcl-2基因的mRNA相对表达量；最后通过RNA-seq研究分析差异表达基因的层次聚类和富集途径。结果：AFB₁对BRL 3A细胞的IC₅₀为15.86 μmol/L，COS浓度小于125 μmol/L时不会对细胞造成毒性损伤；COS可以缓解AFB₁引起的细胞内ROS水平和MDA含量升高，增强SOD和GST酶活性，进而提高细胞自身的抗氧化能力，降低细胞凋亡率；AFB₁可引起促凋亡基因Bax的显著表达（P<0.05），并显著降低Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1的转录水平（P<0.05），而COS预处理则能显著提高Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1基因的表达（P<0.05），显著降低Bax的表达水平（P<0.05）；在RNA-seq的富集途径结果中，COS还可能通过细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路途径来缓解AFB₁诱导的细胞毒性损伤（P<0.05）。结果表明：COS预处理对AFB₁诱导大鼠肝细胞的毒性损伤具有干预作用，其机制可能与Nrf2信号通路、细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路有关。     

ε-聚赖氨酸盐酸盐对腐败希瓦氏菌的作用机制初探

本文从细胞层面初步研究了ε-聚赖氨酸盐酸盐（ε-polylysine hydrochloride, ε-PLH）对腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）的作用机制。通过最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）和微生物生长曲线来判定ε-PLH对腐败希瓦氏菌的抑菌效果。通过电导率、碘化丙啶（PI）摄入量、碱性磷酸酶（AKPase）、乳酸脱氢酶（LDHase）和腺苷三磷酸酶(ATPase)活性分析，结合扫描电镜（SEM）来判定菌体细胞结构的通透性和完整性，以此来综合评价ε-PLH对腐败希瓦氏菌的作用效果。结果得出，ε-PLH对腐败希瓦氏菌的MIC与MBC分别为1.0 mg/mL与2.0 mg/mL。菌体经ε-PLH处理后，其正常生长受到抑制，胞外AKPase与LDHase活性明显提高，细胞膜中的ATPase活性下降，PI摄入量和电导率值与ε-PLH浓度呈显著正相关。由SEM得出，腐败希瓦氏菌经ε-PLH处理后，菌体出现凹陷、孔洞等现象，外观已发生改变。得出腐败希瓦氏菌经ε-PLH处理后，菌体细胞结构受损严重，内容物渗漏，菌体严重变形，最终导致细胞凋亡。研究ε-PLH对腐败希瓦氏菌的作用机制，可为ε-PLH在水产品保鲜中的应用提供理论参考。     

固相萃取-气相色谱法测定葡萄酒中的氨基甲酸乙酯

采用固相萃取法提取葡萄酒中氨基甲酸乙酯,然后用气相色谱法测定,色谱条件为：载气流速1．0mL／min;程序升温50℃（1min）→10℃／min→150℃→3℃／min→220℃（5min）;进样量2．0μL。分析时间为38min。比较了5种净化柱提取除杂效果,选择Cleanert Silica柱作为葡萄酒中氨基甲酸乙酯的萃取柱。以内标法定量,测得相对标准偏差为1．6％、1．2％,回收率在90．4％-101．5％之间。采用本方法测定了8种葡萄酒,氨基甲酸乙酯含量为11．6-30．1μg／L。     

新型硅酸镁(1:6)用于几种蔬菜中4-壬基酚净化效果研究

壬基酚检测需要吸附性能好且成本低的净化材料。通过溶胶-凝胶法制备新型硅酸镁(MS-1:6)材料,考察其吸附性能,作为固相萃取材料用于净化白菜、四季豆、黄瓜、生菜和洋葱5种基质中4-壬基酚,结合液相色谱-串联质谱仪(LC-MS∕MS)测定。结果表明:25℃下新型硅酸镁材料(1:6)对4-NP的最大吸附量为30.84 mg∕g。洗脱液5.0 m L乙腈的条件下对4-NP回收率最高。与商品化吸附材料氨基化多壁碳纳米管(AMCNTs)、多层氧化石墨烯(GO)和N-丙基乙二胺(PSA)相比,MS-1:6对基质效应的降低作用仅次于GO,优于AMCNTs和PSA。具有较高的经济优势,价格仅为GO的1∕1 500。考察MS-1:6循环利用性,结果显示该萃取柱在6次吸附解析循环后,回收率仍在80%以上。平均回收率为88.63%—106.82%,相对标准偏差(RSD)为1.5%—10.86%,检出限为0.6—0.8μg∕kg,定量限为2μg∕kg。该方法简单、快速、成本较低,具有较好的净化效果,能够满足蔬菜中4-壬基酚的检测需要。     

南极曲霉Aspergillus niger NJ49次级代谢产物的分离与鉴定

为挖掘南极真菌的资源应用潜力，对一株南极真菌进行了分子鉴定、次级代谢产物分离及结构鉴定。经ITS rDNA序列分析并构建系统发育进化树，鉴定该菌株为曲霉属真菌，命名为Aspergillus niger NJ49。综合运用Sephadex LH-20和G25凝胶柱层析、半制备高效液相色谱等方法对南极磷虾共附生微生物曲霉属真菌A.niger NJ49的发酵物进行分离和纯化，并利用核磁、质谱等现代波谱学方法进行结构鉴定。从南极曲霉A.niger NJ49中分离鉴定出12个化合物，分别鉴定为Trp-Val-Val(1)、Phe-Val-Val(2)、cyclo-(His, Leu)(3)、cyclo-(Pro, Arg)(4)、(3S,12aS)-3-(Isopropyl)-2,3,6,7,12,12a-hexahydro-pyrazino[1′,2′:1,6]-pyrido[3,4-b]-indole-1,4-dione(5)、cyclo-(Pro, Phe)(6)、cyclo-(Val, Phe)(7)、cyclo-(Pro, Tyr)(8)、cyclo-(Pro, Val)(9)、Phe...     

利用酵母双杂交系统筛选金针菇DASH型隐花色素互作蛋白

提取金针菇（Flammulina filiformis）单核体菌株Dan 3菌丝的总RNA，分离纯化mRNA，合成双链cDNA，依次构建酵母双杂交初级和次级cDNA文库。通过酶切连接法构建诱饵载体pGBKT 7-CRY，其无自激活活性和毒性，与构建的次级cDNA文库共转化酵母感受态细胞，筛选与金针菇DASH型隐花色素（FfCRY-DASH）互作的蛋白，对筛选到的6个蛋白进行回补验证，最终发现一个与金针菇DASH型隐花色素互作的蛋白。     

大球盖菇菌渣原位还田对土壤理化性质及真菌多样性的影响

为了有效利用大球盖菇菌渣,研究了大球盖菇菌渣原位还田对土壤养分(有机质和氮、磷、钾)含量、土壤酶(磷酸酶和脱氢酶)活性及土壤真菌多样性的影响。结果表明:与对照相比,大球盖菇菌渣还田能够显著降低土壤p H,中和土壤酸碱度,并显著提高大田土壤有机质含量以及全氮、全磷、全钾、速效氮、碱性速效磷和速效钾含量。大球盖菇菌渣处理组的土壤磷酸酶和土壤脱氢酶活性均显著高于对照(CK),分别增加30%以上和40%以上。大球盖菇菌渣处理组的土壤真菌多样性低于对照,处理组土壤中优势菌群为Hypocreales(肉座菌目)、Russulaceae(红菇科)、Pezizales(盘菌目)、Saccharomycetales(酵母目)、Bursaria(袋形虫属),对照土壤中优势菌群为Pseudoplatyophyra(拟匙口虫属)、Aleuria(网孢盘菌属)、Onygenales(爪甲团囊菌目)、Trichosporon(丝孢酵母属)、Sordariomycetes(粪壳菌纲)、Sordariales(粪壳菌目)、Basidiomycota(担子菌门)。