新城疫疫苗株与分离毒株的蚀斑克隆与毒力鉴定

2株NDV贵州分离株(GN、ND99)与2株疫苗毒株(Ⅰ系和Ⅱ系)经检测为生物异质性毒株.利用蚀斑克隆技术对以上4株毒株进行蚀斑纯化,结果得到11株克隆毒株.其中,10株克隆毒株在鸡胚成纤维细胞上形成圆形、透明无色蚀斑,1株形成圆形、透明、红色蚀斑.经RT-PCR检测,11株克隆毒株中6株为弱毒,形成蚀斑的大小在0.4～8mm之间;5株为强毒,形成蚀斑的大小在1.0～2.0mm之间.结果表明:所形成蚀斑的大小与病毒毒力具有一定的相关性.     

H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用

为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。     

刚察县伊克乌兰乡牦牛皮蝇蛆感染情况调查

采用剖检法与触摸法,在10、11月份剖检,翌年3、5月份临床检查未使用消毒剂防控的牦牛皮蝇幼虫感染情况.结果剖检牦牛皮蝇一期幼虫平均感染率为61.54％,平均感染强度34.13条.翌年3、5月份触摸检查牦牛背部皮下皮蝇幼虫寄生形成的瘤疱和成熟第三期幼虫脱落形成的皮肤虫孔,3年的平均感染率61.04％,平均感染强度4.9...     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

从巨噬细胞极化角度分析不同油脂饮食对小鼠腹股沟皮下脂肪组织沉积的影响

为分析两种脂肪供能条件下3种不同油脂饮食对小鼠腹股沟皮下脂肪沉积及其巨噬细胞分型的影响,90只C57BL/6J小鼠被随机分为6组,分别饲喂低脂猪油（Lar-10%）、低脂菜籽油（Rap-10%）、低脂橄榄油（Oli-10%）、高脂猪油（Lar-30%）、高脂菜籽油（Rap-30%）和高脂橄榄油（Oli-30%）,16周后解剖取腹股沟皮下脂肪组织,并对其进行苏木精-伊红染色,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量检测,M1、M2型巨噬细胞标记物（CD11c和CD206）荧光双染,并通过ELISA检测其含量。结果表明：1）在低脂饮食条件下,三种油脂对小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量、脂肪细胞横截面积、腹股沟皮下脂肪ROS含量均无显著影响（P>0.05）;2）随着脂肪供能水平的提高,小鼠腹股沟皮下脂肪沉积显著增加（P<0.05）,在高脂饮食条件下,Lar-30%组的小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量显著高于Rap-30%和Oli-30%组（P<0.05）,并且相对于其他两组,Oli-30%组小鼠腹股沟皮下脂肪组织中ROS含量极显著降低（P<0.01）;...     

鸭肠炎病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

设计一对特异性引物扩增出鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因,并将其定向插入到原核表达载体pET32a上,构建了NP基因的原核表达载体pET-NP;将重组载体pET-NP转化表达宿主菌BL21后,经SDS-PAGE分离后行Western blot显示,获得的表达产物具有良好的免疫原性;应用His.Bind亲和层析柱纯化重组NP蛋白,并以此作为包被抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的iNP-ELISA;经方阵滴定确定,重组蛋白抗原的最佳包被浓度为5.0μg/L,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判定标准为:待检血清OD405值≥1.2,且待检血清OD405和阴性血清OD405的比值≥2.0;应用iNP-ELISA对450份鸭血清样本进行检测,结果iNP-ELISA与全病毒包被的iDEV-ELISA符合率达90.9%。     

猪接种PRRSV Nsp2Δ1882-2241弱毒株后血清细胞因子的变化特征

为了解Nsp2Δ1882-2241缺失后弱化的高致病性PRRSV（TJM株）对宿主免疫学应答的刺激机理,本研究分析了免疫猪血清中的细胞因子及变化规律。将14头4周龄易感仔猪随机分为3组：第1组接种PRRSV TJM-F92株,为免疫组;第2组接种高致病性PRRSV TJ-F5毒株,为攻毒组;第3组不接种疫苗及病毒,为对照组。接种后28d,用TJ-F5毒株攻击试验猪,于不同时间点采集血样,用ELISA法测定血清中的PRRSV抗体、IL-2、IL-10、IL-12p40、TNF-α、IFN-α和IFN-β水平。结果显示：（1）与对照组和攻毒组相比,免疫组猪IL-12p40水平持续上调,于免疫后28d受PRRSV强毒攻击后,其水平开始缓慢降低,但仍高于攻毒后的对照组。（2）免疫组IL-2水平在接种疫苗后的前21d内无明显升高且低于攻毒组,在受到强毒攻击后其IL-2水平却有明显升高。（3）免疫组IL-10水平与对照组无明显差别,并在免疫14d后一直显著低于攻毒组（P〈0.01）。（4）免疫组接种疫苗后的前21d内,TNF-α水平保持稳定,28d明显上调。攻毒组TNF-α水平0～28d一直低于对照组,且在21d达到最低（P〈0.01）。免疫组在28d受强毒攻击后,其TNF-α水平下降且在攻毒7d时最为明显（P〈0.01）,此后恢复到正常水平。（5）免疫组免疫后28d时IFN-α水平升高,在受到强毒攻击后再次显著降低（P〈0.01）。免疫组IFN-β水平一直低于对照组和攻毒组,不因强毒攻击而变化。以上结果提示,IL-12上调在PRRSV免疫保护中起明显作用;另外,上调TNF-α及下调IL-10都是基因缺失疫苗发挥效力的潜在机制。     

复方中草药制剂治疗獭兔毛癣病的试验

在四川省内的5个毛癣病发病獭兔养殖场,选择520只有临床症状表现的病兔,分别用复方中草药配方制剂和灰黄霉素进行治疗,观察其治疗效果。结果表明,复合中草药配方制剂的治愈率为72.59%,灰黄霉素的治愈率为70%,两种药物对毛癣病的治疗效果差异不显著(P>0.05),证明复合中草药配方制剂治疗獭兔毛癣病的效果与灰黄霉素的疗效一致。     

鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速的鲤浮肿病毒(CEV)重组酶介导的链替换扩增(RAA)检测方法,本研究通过比较分析CEVP4a基因序列,设计引物与探针,经过筛选优化,建立了实时荧光RAA检测方法。结果显示,该方法在39℃恒温反应20min即可快速、特异性地检测出CEV,与常见的鱼类病毒不发生交叉反应,其对质粒标准品的检测下限为2.8×10^1拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于5%。利用本研究建立的方法对35份临床鲤科鱼类样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。本研究建立的检测方法操作简单,特异性强、敏感性高,结果可靠,不依赖于复杂的仪器,适用于现场对CEV的快速检测。     

多重实时荧光定量PCR鉴别欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV检测方法的建立

根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%;灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因。该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控。